血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白水平与卒中发生及患者肾功能损害的关系

杨渝伟，陈小红，胡　冬，余　琳，俸家富

(绵阳市中心医院检验科，四川绵阳　621000)

脑卒中是一种突发性脑血循环障碍性疾病，临床上分为出血性脑卒中(hemorrhagic stroke，HS)和缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)两大类。据WHO GDB2016报道，脑卒中在中国为第二大死因和首位致残病因，严重影响患者生活质量[1]。研究证实，高血压、糖尿病、冠心病和高尿酸血症等是脑卒中的危险因素[2]，同时也是慢性肾病(chronic kidney diseases，CKD)和急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的重要诱因，近年来研究证实，其肾功能不全与脑卒中的发病风险、复发及结局关系密切[3～5]，但也有学者对此存有异议[6]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)作为新兴的早期肾损伤的诊断标志物已被广泛接受，然而到目前为止，其与脑卒中关系的研究较少。因此，本文以探讨血清NGAL及传统常用肾脏标志物水平与脑卒中的关系，为卒中发生的防治提供新的思路。

1　材料和方法

1.1研究对象随机选取2017年3～10月绵阳市中心医院首诊脑卒中患者296例，包括HS患者63例和IS患者233例，其中男性115例，女性181例，年龄23～65岁，平均年龄53.9±8.5岁。所有病例均经头颅CT和/或磁共振成像(MRI)证实，诊断符合美国心脏协会/美国卒中协会(AHA/ASA)指南标准[7，8]，并排除原发性肾脏疾病、脑外伤、周围血管病、血液病、自身免疫疾病、恶性肿瘤和严重感染患者。入选脑卒中患者根据入院前后48h内血清肌酐(creatinine，Cr)和尿量监测结果，按照改善全球肾脏病预后组织(kidney disease improving global outcomes，KDIGO) 2012AKI指南[9]标准，48 h内Cr增加超过26.5 μmol/L，或尿量<0.5 ml/kg/h超过6 h，筛选出AKI患者15例；而其它非AKI脑卒中患者根据既往肾功能和尿蛋白检查结果，按照KDIGO 2012CKD指南[10]标准，eGFR≤60 ml/min/1.73m2或ACR≥30mg/g Cr超过3个月，筛选出CKD患者54例。由此将所有脑卒中患者分为3组：AKI组(A组)，CKD组(B组)和一过性或无肾损伤组(C组)，即既往3个月内eGFR>60 ml/min/1.73m2且ACR<30 mg/gCr患者。同期选择肾功能检测正常的门诊健康受试者293例作为对照组(D组)，其中男性110例，女性183例，年龄21～65岁，平均年龄52.3±11.6岁。

1.2试剂和仪器血清肾脏标志物检测：尿素(Urea)采用比色法，Cr采用肌氨酸氧化酶法，胱抑素C(cystatin C，CysC)和NGAL采用透射比浊法，试剂盒均为四川迈克生物科技股份有限公司产品。检测仪器LST008型全自动生化分析仪为日本Hitachi公司产品。

1.3方法所有受试者入院时均记录年龄、性别以及高血压、糖尿病、冠心病和高尿酸血症病史，并在其入院次日或健康体检时于清晨空腹，用BD Vacutainer○RSST ⅡAdvance管抽取静脉血约5ml，颠倒混匀8次，静置约30 min，再3 000 r/min离心15 min，分离血清，2 h内测定其血清NGAL，Cr，Urea和CysC水平。受试者eGFR采用基于中国人群开发的方程[11]来计算：。

eGFR=78.64×Cys C(mg/L)-0.964

1.4统计学分析采用SPSS19.0和MedCalc11.5统计软件进行数据处理。非正态分布的计量资料以M(min，max)表示，多组间差异及其两两比较采用独立样本Kruskal-Wallis检验及其平均秩多重比较。所有受试者按D组 ～ A组分组顺序分别记为1 ～ 4，代表肾功能损害程度；然后采用多元线性回归分析卒中发生及患者肾功能损害程度与各观察指标的关系密切程度，用偏相关系数来表示，取值越大表明关系越密切，为正(或负)表明呈正(或负)相关。患者相关危险疾病病史率采用n(%)表示，组间率的比较采用χ2检验。各肾脏标志物异常率采用n(%)表示，其在相同肾功能损害分组内差异采用Cochran’s Q检验及多重比较法。血清肾脏标志物是否脑卒中的危险因素，采用logisitic回归分析，以OR(95%CI)反映其危险程度。当P<0.05时，表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1受试者基本资料经单样本Kolmogorov-Smirnov正态性检验，所有计量资料均呈非正态分布(Z=2.029 ～ 6.247，均P<0.05)，因此差异比较采用Kruskal-Wallis检验(用χ2表示统计量)。健康对照、HS和IS患者各观察指标检测结果列于表1。经Kruskal-Wallis或χ2检验，不同疾病受试者之间：①年龄差异和性别差异均无统计学意义(均P>0.05)；②Cr，CysC，eGFR和NGAL水平的差异均有统计学意义(均P<0.001)；③在HS和IS患者间，高血压和冠心病病史率的差异均有统计学意义(均P<0.001)，而糖尿病和高尿酸血症病史率差异则无统计学意义(均P>0.05)。经Kruskal-Wallis平均秩多重比较，HS患者和IS患者Cr(Z=2.974，5.150，均P<0.05)，CysC(Z=2.535，7.239，均P<0.05)和NGAL(Z=12.621，9.189，均P<0.05)血清水平均高于健康对照，而eGFR则相反(Z=2.974，5.150，均P<0.05)；但不同卒中患者间Cr(Z=2.121，P=0.102)，CysC(Z=2.245，P=0.077)，NGAL(Z=2.332，P=0.059)和eGFR(Z=2.332，P=0.077)的差异均无统计学意义。

表1

受试者临床特征及实验室检测结果

注：△χ2检验，其余采用Kruskal-Wallis检验；a与IS患者相比P<0.05；b与HS患者相比P<0.05。

2.2不同肾功能损害患者及健康对照肾脏标志物血清水平见表2。结果显示，各组肾脏标志物血清水平差异均具有统计学意义(均P<0.001)。经Kruskal-Wallis平均秩多重比较，除C组与D组间Urea(Z=1.095，P=0.274)和Cr(Z=1.511，P=0.131)的差异无统计学意义外，其余任意两组间Urea(Z=2.467～5.986，均P<0.05)，Cr(Z=2.451～7.625，均P<0.05)，CysC(Z=2.180～6.941，均P<0.05)，eGFR(Z=2.180～6.941，均P<0.05)，NGAL(Z=3.661～11.237，均P<0.05)的差异，均具有统计学意义(均P<0.05)。

表2

不同肾功能分组患者及健康对照肾脏标志物血清水平[M(min,max)]

2.3不同类型卒中患者卒中发生及其肾功能与各观察指标的关系见表3。结果显示，与HS发生关系密切的依次是：高血压>NGAL>冠心病>糖尿病>高尿酸血症>Cr>Urea>性别(均P<0.05)，而年龄、CysC和eGFR则关系不密切(P>0.10)；与IS发生关系密切的依次是：冠心病>糖尿病>NGAL>性别>高尿酸血症>Cr>CysC(均P<0.05)，而年龄、Urea，eGFR和高血压则关系不密切(P>0.10)。HS患者中除外糖尿病，IS患者除外高血压，各观察指标均与患者肾功能损害程度相关(均P<0.05)，其中关系最密切者均为NGAL。

表3

不同类型脑卒中及患者肾功能损害的相关因素

注：▲HS患者与健康对照进行多元线性回归分析；#IS患者与健康对照进行多元线性回归分析；*rp即为偏相关系数，取值越大表明关系越密切，为正(或负)表明呈正(或负)相关；“-”表示该指标因关系密切程度小，经显著性检验P>0.10而被移除，因而未计算其rp。

2.4血清肾脏标志物的异常率见表4。以超过参考值上限为异常，5种肾脏标志物异常率，在A组内差异均无统计学意义(P>0.05)，但在B，C或D组内NGAL异常率均高于其它指标(P<0.05)。此外，其余4个指标中，仅B组内eGFR异常率低于Cr和CysC(均P<0.05)。

表4不同肾功能损害程度受试者血清肾脏标志物异常率[n(%)]

肾脏标志物A组(n=15)B组(n=54)C组(n=227)D组(n=293)UreaCrCysCeGFRNGAL9(60.0)13(86.7)12(80.0)11(73.3)14(93.3)15(27.8)28(51.9)#29(53.7)#12(22.2)43(79.6)▲13(5.7)15(6.6)20(8.8)10(4.4)96(42.3)▲0(0.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)14(4.8)▲QP7.7900.10047.845<0.001298.964<0.00156.000<0.001

注：经Cochran’s Q检验多重比较，▲与其它指标相比P<0.05；#与eGFR相比P<0.05。

2.5血清肾脏标志物在不同类型脑卒中患者中危险程度分析以健康对照为参照，采用logistic回归分析分析肾脏标志物血清水平及其异常与卒中间的关系。结果显示，以血清水平进行分析，仅NGAL是HS的危险因素[OR(95%CI)=1.044(1.035，1.053)，P<0.001]，而eGFR和NGAL则是IS的危险因素[OR(95%CI)=0.974(0.959，0.989)，1.028(1.020，1.036)，均P<0.01)]。以其异常来分析，仅NGAL异常是IS和HS的危险因素[OR(95%CI)=15.411(8.152，29.137)，27.841(14.969，51.784)，均P<0.001)]。

3讨论关于肾功能损害与脑卒中的关系，国内外的研究报道不相一致。众多研究证实，肾功能损害与脑卒中相关[12]，其争议主要集中在是否可作为IS和HS患者独立的预测因素[13]。

甚至有学者报道，在传统的肾功能指标中，不是血清肾脏标志物(包括eGFR)，而是反映蛋白尿的指标，才是CKD患者卒中发生的预测因子[14]。但迄今为止，究竟肾功能损害能否作为脑卒中的预测因素，以及使用哪个或哪些肾脏标志物来预测，仍然众说纷纭。

NGAL是1993年Kjeldsen等首先发现的与中性粒细胞明胶酶共价结合的蛋白，故称为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，又称为人中性粒细胞脂质运载蛋白、脂质运载蛋白-2、噬铁蛋白或24p3，属于脂质运载蛋白超家族成员。在正常情况下，NGAL是在早期髓细胞分化阶段合成，成熟中性粒细胞却并不表达，在成人各种组织中低水平表达[15]。近年来，NGAL在脑卒中发病机制的相关研究中倍受关注。Segal等[16]从牛津大学血管病研究(OXVASC)数据库筛选出1 292例短暂性脑缺血发作或脑卒中患者进行大样本研究，指出包括NGAL在内的14项炎症、血栓和细胞损伤相关指标，对亚急性卒中复发的早期预测作用有限。本实验探讨肾脏标志物血清水平与脑卒中的关系，结果显示，不论是IS还是HS患者，5个血清肾脏标志物中：①除Urea外，Cr，CysC，NGAL和eGFR水平与健康对照的差异均有统计学意义；②NGAL与HS或IS发生的关系最为密切；③以其血清水平进行分析，仅NGAL均是HS和IS发生的危险因素，但其OR值均接近于1，预测作用均有限，这点与上述研究报道基本一致；④以其异常率来分析，仅NGAL是IS和HS的危险因素，其OR值分别高达15.411和27.841，具有较高的预测价值。以上结果均表明，NGAL是独立于糖尿病、高血压、冠心病和高尿酸血症等的脑卒中危险因素。

NGAL作为早期急慢性肾损伤的生物标志物已被广泛接受，但同时又是一种急性时相蛋白，在短暂性脑缺血发作或脑卒中早期，患者可因潜在的炎症或应激等病理状态，使其血清水平升高。本次试验发现，不同程度肾功能损害的脑卒中患者中，其NGAL异常率均高于其它肾功能指标。NGAL不仅在并发有AKI或CKD的脑卒中患者中呈高表达，而且在一过性或无肾损害的脑卒中患者也呈高表达，其异常率依次为93.3%，79.6%和42.3%。而健康对照中NGAL异常率仅4.8%，与参考值内涵并不排除5%小概率事件发生相吻合。由此可见，NGAL在脑卒中患者中作为一种急性时相蛋白的作用不容忽视，推测其血清水平升高可能是各种原因所致早期肾损伤，与卒中早期病灶炎症反应或应激刺激的共同结果。因此，NGAL既是卒中患者肾损伤的标志物，也有可能成为卒中发生的独立预测因子。但是迄今为止，NGAL的应用研究更多集中在对短暂性脑缺血或卒中发作后复发预测和预后评估上[16，17]。由于受肾损伤所致血清水平增高的影响，NGAL对脑卒中的预测作用，可能在尚无明显肾功能损害的患者中更具有意义。这点尚需大量的随访研究加以证实，尤其是对卒中发生前高危疾病的追踪验证，或是短暂性脑缺血发作患者的大样本研究。

此外，NGAL检测在脑卒中患者中的应用价值，还在于其与患者肾功能损害之间的关系上。尽管NGAL被认为是肾损伤而非肾功能的标志物[18]，但肾损伤常伴有肾功能损害。本次试验发现，NGAL与肾功能指标一样，随着肾功能损害加重，其血清水平逐渐升高，并且NGAL与患者肾功能损害的关系最为密切，而肾功能指标与患者肾功能损害的关系密切程度，甚至均低于脑卒中危险因素(即糖尿病、高血压、冠心病和高尿酸血症)。由此可见，NGAL也可以用来准确反映患者肾功能损害，甚至比传统肾功能指标更加敏感。

本研究的局限性在于：①病例可能存在选择偏倚，特别是为确保患者入院时正处于AKI发生阶段，实验设计为入院前后48h内进行判断，难以检出7天内Cr水平升高超过基线水平1.5倍的AKI患者；②实验室检测在患者入院后第2天进行，难以避免入院前7天内服药的影响。因此实验结果存在混杂因素，但就目前的实验结果来说，可以提示NGAL可能是脑卒中的危险因素。临床可考虑动态监测NGAL，以便采取个体化的预防和治疗措施。

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