1 株猪源大肠杆菌O 抗原的鉴定及其耐药试验

申子平, 郭丹丹, 孔庆娟, 王铁岗, 原慧斌

(1.长治职业技术学院动物科学系, 山西 长治046000 ;2.四川恒通动物制药有限公司, 四川 内江641000)

山西省长治某规模猪场为一新建场,因为管理不善,致使产房3 日龄内仔猪多数发病。 主要症状为粪便稀、黄,消瘦,最后脱水衰竭而死。 剖检见肠黏膜充血、水肿,肾出血,淋巴肿大等病变。 初步诊断为仔猪黄痢。 为了进一步确诊和防治该病,进行了大肠杆菌抗原类型的鉴定和耐药性试验。

1 材料

1.1 试剂 麦康凯(MC)琼脂和营养肉汤由北京索莱宝科技有限公司生产;伊红美蓝(EMB)琼脂培养基由宿迁华夏生化科技有限责任公司生产;营养琼脂由北京奥博星生物技术有限公司生产;微量生化管由青岛海博生物有限公司生产;药敏片由上海腾骞生物科技有限公司生产;大肠杆菌单因子血清由中国兽医药品监察所生产。

1.2 仪器 恒温培养箱,购自上海博泰实验设备有限公司;低温冰箱,购自青岛海尔股份有限公司;压力蒸汽灭菌锅,购自上海申安医疗器械厂;微量移液枪,购自大龙兴创实验仪器有限公司;电子天平,购自北京赛多利斯仪器有限公司。

1.3 病料 截取山西省武乡县某规模养猪场拉黄稀粪便仔猪的十二指肠作为病料。

2 方法

2.1 病菌的鉴定

2.1.1 分离和镜检病菌 无菌条件下接种十二指肠病料到MC 琼脂上,37 ℃温度下培养18 h。 然后从MC 琼脂上挑取单个的粉红色菌落,接种到普通肉汤、EMB 琼脂、普通琼脂上,37 ℃温度下24 h 的培养。 分别挑EMB 琼脂和MC 琼脂上的菌落,进行涂片和染色,用显微镜的油镜观察。

2.1.2 生化试验检测 用分离菌进行生化检测,检测项目有：乳糖、山梨醇、蔗糖、H2S、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、M. R、柠檬酸盐、尿素酶、三糖铁、V-P、肌醇和赖氨酸等。

2.2 毒力测定 测定试验用小鼠(体重25 g)进行。 采用腹腔接种的方法,每组接种3 只小鼠。 试验组：先用肉汤稀释肉汤培养物至5 亿/mL,再用注射器抽取0.2 mL 稀释后的培养物进行接种。 对照组：接种0.2 mL 无菌肉汤。 接种后详细记录小鼠症状及死亡情况。 若3 d 内全部死亡则判定病菌有强致病性、高毒力;发病死亡2 只,判定有中等致病性和中等毒力;发病死亡1 只,判定有低致病性和低毒力;零死亡,判定为无致病性和无毒力。

在MC 琼脂上接种病死鼠的心血。 培养后镜检。

2.3 病菌抗原类型测定 对生化试验符合大肠杆菌特点的分离菌进行O 抗原类型的鉴定。 先用普通琼脂纯化生化鉴定后的细菌,再用石炭酸(5 mL/L)生理盐水冲洗,稀释(1 ×1010CFU/mL)。经2 h,121 ℃高压灭菌[1]。 试验玻片凝集法：用移液枪往玻片上滴一滴稀释后的细菌液,再往细菌上滴一滴定型血清,混匀后反应5 min。 如液滴明显凝集,判定反应为阳性。 为防止自凝,用无菌生理盐水和菌液混合设为对照。

2.4 耐药试验 用药敏试纸片进行试验。 试纸片有卡那霉素、头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、阿莫西林、利福平、链霉素、头孢唑啉、庆大霉素、阿米卡星、呋喃唑酮和头孢曲松等[2-3]。

3 结果

3.1 鉴定结果 见表1。

表1 病菌鉴定结果

3.2 毒力测定结果 经过用小鼠试验,试验组的小鼠全部在48 h 内死亡。 说明该株细菌的致病性强、毒力高。 剖检死亡小鼠,见有肝和脾肿大,肝面有坏死和出血。 采集肝作为病料,接种、培养后鉴定,符合大肠杆菌特征。

3.3 O 抗原鉴定结果 经O 抗原鉴定试验,发现单因子O8血清中出现了凝集,所以该株大肠杆菌的O 型抗原为O8。

3.4 耐药试验结果 见表2。 由表2 得出,该株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢曲松、阿米卡星和呋喃唑酮敏感;对头孢唑啉、卡那霉素、头孢噻肟等中度敏感;而对环丙沙星、链霉素和利福平等耐药。

表2 耐药试验结果

4 讨论

4.1 关于毒力 经过试验,得出该场流行的仔猪黄痢的病原为O8血清型的大肠杆菌。 针对该菌做了毒力强弱的测定,发现该型细菌致病性强、毒力高,这和该场生产中仔猪成批死亡,病死率高达43%相符。 为减少该病的发生,建议自制疫苗进行预防。

4.2 关于耐药性 试验找出了该株细菌对氧氟沙星、头孢曲松、阿米卡星和呋喃唑酮敏感。 建议该养殖场在仔猪黄痢的治疗上选用这4 种作用效果好的药物,弃用环丙沙星、卡那霉素、利福平等作用效果不明显的药物[4]。

试验结束后,在该场的仔猪黄痢防治上,采纳了讨论部分的建议,防治效果明显。 大肠杆菌血清型众多,可引起仔猪多种疾病,所以就出现了防治难的困境。 建议养殖场能明确本场存在的大肠杆菌的血清型,自制疫苗进行预防[5];再找出其高效的抗菌药,并合理用药;同时要加强管理。 这样才能控制大肠杆菌病在场内传染,才能提高仔猪的存活率。