核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾产卵选择以及幼虫钻蛀性的影响

王春娅,胡纯华,刘 燕,王 静,戚敬威,唐国文,肖 春**

(1.云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201;2.云南农业大学 职业与继续教育学院,云南 昆明 650201)

在与寄主植物的协同进化过程中,蛾类昆虫能利用植物产生的化学信息区分寄主/非寄主植物,以便高效选择合适的取食、产卵场所,为后代种群的繁衍奠定基础。而在非寄主植物中通常含有抑制植食性昆虫取食或产卵的化学物质,这些物质的存在既是植物抵御害虫为害的重要手段,也是用于研发新型害虫防治技术的重要化学信息来源。因此,植物尤其是非寄主植物产生的化学信息物质可用于调控植食性昆虫的产卵行为以达到控制害虫为害的目的[1-2]。

马铃薯块茎蛾(Phthorimaeaoperculella)是一种寡食性昆虫,其寄主范围狭窄,仅限于茄科植物[3]；该虫在自然状态下尤其喜好在马铃薯(Solanumtuberosum)块茎的芽眼和伤口上产卵,当卵孵化后,幼虫蛀入块茎、叶片和茎的组织中取食为害，形成弯曲的虫道,蛀孔外有深褐色粪便排出[4-5]；在4龄期结束后钻到土里化蛹[6]；其整个过程给害虫防治带来极大的困难,是马铃薯贮存期的最重要害虫[7]。据有关报道,自然贮存半年以上的马铃薯块茎被害率可达100%[1]。因此,寻找安全、高效的方法控制马铃薯块茎蛾为害具有重要的意义。

核桃(Juglansregia)属于胡桃科胡桃属,是马铃薯块茎蛾的非寄主植物之一,在云南多地均有种植[8]。研究表明,许多核桃科植物除了果仁部分具有丰富的营养价值和药用价值外,植物本身还具有化感、杀虫等生物活性,是一类潜在的生物农药资源[9-11]。而在核桃中是否存在着影响植食性昆虫行为的化学信息物质目前知之甚少。因此，我们研究了核桃叶提取物对马铃薯块茎蛾产卵行为以及幼虫钻蛀性的影响。

1　材料与方法

1.1　供试虫源

马铃薯块茎蛾幼虫用马铃薯块茎(品种为合作88)饲养,成虫羽化后喂以10%蜂蜜水。选取活性较强的初孵幼虫作为供试幼虫。室内饲养环境条件为温度(27±2)℃,光照比(L∶D)=14∶10,相对湿度为50%～70%。

1.2　供试材料

新鲜核桃叶片采自云南农业大学校园；无水乙醇(纯度>99%)和二氯甲烷(纯度>99.5%)均购置于市场。

新鲜核桃叶片提取物的制备:称取适量的新鲜核桃叶片，用粉碎机粉碎，然后分别置于无水乙醇和二氯甲烷中浸泡6 h,配制成浓度分别为2、6、18、54、162 gE/L的粗提物溶液，备用。

1.3　核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾产卵选择以及交配率的影响

先将新鲜的马铃薯块茎洗净，然后在粗提物溶液中浸泡5 s后取出、晾干。取3个大小相近的经粗提液浸泡的块茎(约100 g)置于长方形塑料容器(40 cm×32 cm×18 cm)内底部一侧作为处理；将另外3个经相应纯溶剂浸泡的块茎置于容器底部另一侧作为对照,处理块茎与对照块茎相距8.0 cm。容器上端开口用铁丝网(400目)封住,之后向容器中接入5对1日龄成虫，放入10%蜂蜜水为成虫提供营养。实验4次重复,环境条件同上。3 d后检查处理组和对照组的马铃薯块茎表皮上的总落卵量；之后解剖雌成虫,通过检查贮精囊内有无精苞以确认雌成虫是否已交配,并统计交配率。

1.4　核桃叶粗提物对幼虫钻蛀性的影响

1.4.1非选择性钻蛀将新鲜马铃薯块茎洗净后在粗提物溶液中浸泡5 s后取出、晾干,取1个块茎置于塑料容器(口径15 cm×底径10 cm×高9 cm)底部,将15头初孵幼虫接到块茎上并用保鲜膜封口；7～10 d后剖开块茎，统计块茎内的幼虫数量；以经相应溶剂浸泡的块茎作为对照,并重复4次。

1.4.2选择性钻蛀将洗净的马铃薯块茎浸泡于粗提物中,5 s后取出晾干,取1个置于方形塑料容器(长16 cm×宽11 cm×高6 cm)底部一侧作为处理,另取1个经过溶剂浸泡的块茎置于底部另一侧作为对照,对照块茎与处理块茎之间相距5 cm；将15头初孵幼虫接于两个块茎的距离中心,并用保鲜膜封口；7～10 d后剖开块茎，清点块茎内的幼虫数量；实验重复4次。

1.4.3粗提物驱避效果的持续时间分别于实验前36、24、12 h浸泡马铃薯块茎5 s,然后将浸泡过的块茎分别置于塑料容器中,并同时接入15头初孵幼虫,7～10 d后剖开块茎，清点块茎内的幼虫数量；实验以相应溶剂浸泡的块茎作为对照；实验重复4次。

1.5　数据分析

2　结果与分析

2.1　核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾产卵选择的影响

2.1.1核桃叶乙醇粗提物对马铃薯块茎蛾产卵选择的影响行为测试结果(图1)表明,核桃叶乙醇粗提物对马铃薯块茎蛾的产卵表现出极显著的抑制效果(当浓度为2 gE/L时,df=6,2=54.346;当浓度为6 gE/L时,df=6,2=186.992;当浓度为18 gE/L时,df=6,2=53.622;当浓度为54 gE/L时,df=6,2=272.265;当浓度为162 gE/L时,df=6,2=884.525),而且随着浓度的升高粗提物对雌蛾的产卵抑制作用进一步增强,例如,在粗提物浓度为2 gE/L时,处理组块茎上的落卵量与对照组的落卵量之比为0.65,而当粗提物浓度升高至162 gE/L时,处理组块茎上的落卵量与对照组的落卵量之比只有0.06。

图1　核桃叶乙醇粗提物对马铃薯块茎蛾产卵选择的影响

2.1.2核桃叶二氯甲烷粗提物对马铃薯块茎蛾产卵选择的影响从实验结果(图2)可以看出,核桃叶二氯甲烷粗提物对马铃薯块茎蛾产卵的抑制效果随着其浓度的升高而逐渐增加,例如,在粗提物浓度为2 gE/L时,处理块茎上的落卵量为(75.8±6.6)粒,而对照组的落卵量为(130.8±19.0)粒,前者极显著低于后者，为后者的58.0%;而当粗提物浓度升高至162 gE/L时,处理块茎上的落卵量只有对照上的9.8%(当浓度为2 gE/L时,df=6,2= 67.476;当浓度为6 gE/L时,df=6,2=12.044;当浓度为18 gE/L时,df=6,2=97.324;当浓度为54 gE/L时,df=6,2=299.093;当浓度为162 gE/L时,df=6,2=703.738)。

图2　核桃叶二氯甲烷粗提物对马铃薯块茎蛾产卵选择的影响

2.2　核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾雌蛾交配率的影响

从图3可以看出,在浓度2～162 gE/L范围内,两种核桃叶粗提物在同一浓度下对马铃薯块茎蛾交配率的影响均无显著差异,且与对照组间的差异均没有达到显著性水平，这说明两种核桃叶粗提物没有干扰马铃薯块茎蛾两性成虫交配行为的功效。

图3　两种核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾雌蛾交配率的影响

2.3　核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫非选择性钻蛀行为的影响

2.3.1核桃叶乙醇粗提物对块茎蛾幼虫非选择性钻蛀的影响实验结果(图4)表明,乙醇粗提物各个浓度对块茎蛾幼虫的钻蛀行为都有驱避作用,当浓度为18、54、162 gE/L时处理块茎与对照块茎内的幼虫数量具有显著差异(当浓度为18 gE/L时,F=0.231,t=3.595,df=6,P=0.011;当浓度为54 gE/L时,F=0.231,t=3.595,df=6,P=0.011;当浓度为162 gE/L时,F=0.273,t=2.275,df=6,P=0.043)，并且在浓度为162 gE/L时,处理块茎内的幼虫数量为(2.8±1.5)头,只有接入幼虫总量的1/3左右。

图4　核桃叶乙醇粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫非选择性钻蛀的影响

2.3.2核桃叶二氯甲烷粗提物对块茎蛾幼虫非选择性钻蛀的影响由图5可见，核桃叶二氯甲烷粗提物对块茎蛾幼虫的钻蛀也有驱避作用,并且随着浓度的升高驱避作用逐渐增加,当浓度为54和162 gE/L时处理块茎与对照块茎内的幼虫数量分别表现出显著和极显著差异性(当浓度为54 gE/L时,F=0.273,t=0.620,df=6,P=0.012;当浓度为162 gE/L时,F=0.152,t=5.357,df=6,P=0.002),而且当浓度达到最高时处理块茎内的幼虫数量为(0.8±0.7)头,是接入幼虫总数量的1/20左右。

图5　核桃叶二氯甲烷粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫非选择性钻蛀的影响

2.4　核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫选择性钻蛀行为的影响

2.4.1核桃叶乙醇粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫选择性钻蛀的影响研究结果(图6)表明：当浓度在2～18 gE/L范围内时,乙醇粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫的选择性钻蛀表现出引诱作用；当浓度在54～162 gE/L范围内时则表现出强烈的驱避作用,并且当浓度为54 gE/L时处理和对照块茎内幼虫数量之间表现出显著性差异(df=6,2=6.349),当浓度为162 gE/L时处理和对照之间表现出极显著差异(df=6,2=19.551)。

2.4.2核桃叶二氯甲烷粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫选择性钻蛀的影响从图7可以看出：当浓度为2和18 gE/L时,核桃叶二氯甲烷粗提物对块茎蛾幼虫的选择性钻蛀有引诱作用,在其余浓度下则有驱避作用,并且当浓度为54 gE/L和162 gE/L时处理和对照块茎内幼虫数量之间具有极显著差异(当浓度为54 gE/L时,df=6,2=20.933;当浓度为162 gE/L时,df=6,2=26.630),而且在这两个浓度下对照块茎内的幼虫数量都是处理块茎内的5倍以上。

图6　核桃叶乙醇粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫选择性钻蛀的影响

2.5　核桃叶粗提物对块茎蛾幼虫钻蛀行为的药效持续时间

2.5.1核桃叶乙醇粗提物的药效持续时间由表1可知：当浓度为2 gE/L和6 gE/L时,乙醇粗提物在各个时间都对块茎蛾幼虫具有引诱作用；当浓度为54 gE/L时,乙醇粗提物对幼虫表现出驱避作用,且在24 h和36 h时处理与对照之间均具有显著性差异(时间24 h,F=1.500,t=3.130,df=6,P=0.020;时间36 h,F=1.929,t=2.849,df=6,P=0.029)；当浓度为162 gE/L时,在12 h和36 h时处理与对照块茎内幼虫数量之间均具有显著性差异(时间12 h,F=7.500,t=3.273,df=6,P=0.017;时间36 h,F=1.800,t=3.656,df=6,P=0.011)。

图7　核桃叶二氯甲烷粗提物对马铃薯块茎蛾幼虫选择性钻蛀的影响

表1　经不同浓度核桃叶乙醇粗提物浸泡后块茎内的块茎蛾幼虫数量 头

注:“*”表示在处理和对照间差异显著(P<0.05,t检验)。下同。

2.5.2核桃叶二氯甲烷粗提物的药效持续时间由表2可知：在2～162 gE/L浓度范围内除18 gE/L外,其余浓度的核桃叶二氯甲烷粗提物都对块茎蛾幼虫具有驱避作用,且当浓度为54 gE/L、时间为36 h时,块茎内的幼虫数量在处理和对照之间存在显著性差异(F=0.904,t=3.313,df=6,P=0.016)；当浓度为162 gE/L、时间为12 h和36 h时,处理和对照之间块茎内幼虫数量差异显著(时间12 h,F=2.700,t=3.036,df=6,P=0.023;时间36 h,F=1.929,t=3.434,df=6,P=0.014)。

表2　经不同浓度核桃叶二氯甲烷粗提物浸泡后块茎内的块茎蛾幼虫数量 头

3　结论与讨论

植食性昆虫之所以能够精准识别寄主与非寄主植物,是因为化学因素发挥了极为重要的作用。通过对不同植物化学信息的识别,植食性昆虫可以选择在合适的植株上产卵,以便为后代选择合适的生存场所,从而保证自身种群的繁衍。利用植食性昆虫与寄主/非寄主植物之间的这种化学联系,人们可以从众多非寄主植物中寻找出那些能够影响害虫产卵选择性的特殊信息化合物,以发展新型的害虫行为调控技术,进而达到安全、高效控制害虫为害的目的[12-13]。

本实验结果显示,用两种溶剂获得的核桃叶粗提物均对马铃薯块茎蛾的产卵表现出显著的抑制效果,而且乙醇粗提物的抑制作用更强。这表明在核桃叶中存在着能够显著影响马铃薯块茎蛾产卵行为的化学成分,也说明了核桃叶的活性成分更容易为乙醇所提取。这一结果为进一步从核桃叶中分析、鉴定相关活性成分奠定了基础。

更进一步的行为观察结果表明,在2～162 gE/L范围内,雌蛾交配率在不同浓度粗提物处理与对照之间均无显著差异。这说明,在非寄主植物核桃叶片中应该不存在干扰马铃薯块茎蛾雌虫交配行为的化学物质;而在影响雌虫产卵选择性方面,粗提物可能主要是通过影响雌蛾的接触选择性而起作用的,也就是说,雌蛾在通过产卵器、触角等感受器官在接触而非嗅到马铃薯块茎表面的核桃提取物后,放弃了在其上的产卵。这可能是核桃提取物影响马铃薯块茎蛾产卵选择性的机制之一。

有研究表明,非寄主植物滇杨(Populusyunnanenesis)和桉树(Eucalyptusrobusta)的叶片提取物对马铃薯块茎蛾的产卵行为表现出显著的驱避作用[12,14]。但从行为生测结果来看,这两种非寄主植物的叶片粗提物对马铃薯块茎蛾的产卵抑制效果远不及核桃叶粗提物产生的效果。这显示核桃叶片中的化学物质在马铃薯块茎蛾产卵行为的调控中具有较大的应用潜力。

幼虫主要通过口器以及足上的感受器来判断、区分寄主与非寄主植物,所以当幼虫接触沾有粗提物的马铃薯块茎时首先是四处爬行以寻找芽眼[15]等容易钻蛀的地方,其次是通过感受粗提物的性质及浓度等来判断能否直接钻蛀。所以在本选择性实验的低浓度2～18 gE/L范围内,粗提物对块茎蛾幼虫的钻蛀的驱避作用没有随着浓度的增加而增强,这可能是因为块茎表面的粗提物较少,幼虫能够忍受并蛀食。

室内研究表明初孵的马铃薯块茎蛾幼虫能够存活36 h左右,也就意味着幼虫自接触块茎起就一直爬行并尝试钻蛀,所以粗提物能否阻止幼虫蛀食,主要依靠药效持续时间。由表1～表2可知,两种粗提物不同浓度都对块茎蛾幼虫的钻蛀有驱避作用,并且处理和对照间的显著性差异大多数出现在36 h,也就是说药效并未随着时间的推移而减退,这表明粗提物中具有驱避作用的化学成分可能来源于低挥发性物质,也进一步说明即使幼虫在36 h后仍然在尝试钻蛀，粗提物仍能在一定程度上阻止幼虫蛀食。

当今对马铃薯块茎蛾的防治仍然以化学药剂防治为主,例如：朱国庆等研究表明用80%敌敌畏乳剂350～400 mL/m2熏蒸96 h,对1～3日龄马铃薯块茎蛾幼虫的致死率达95%～100%,对其蛹、成虫的致死率达80%左右[16]；钱念曾等用溴甲烷熏蒸3 d，每天熏蒸2 h,可杀死各种虫态的块茎蛾[17]。虽然化学药剂防治效果显著,但仍未彻底解决块茎蛾为害的问题,反而导致害虫抗性以及3R问题的产生。因此生物防治将成为防控马铃薯块茎蛾的主要方法。现在对马铃薯块茎蛾,大都采用非寄主植物的气味、粗提物进行产卵驱避,有研究表明山胡椒的20 g压碎果实对块茎蛾的产卵驱避作用达到93.7%[18]；当细辛的浓度增加至1.38 g/L时对马铃薯块茎蛾的产卵抑制作用显著增强,抑制率达84.5%[19]。但是上述产卵驱避剂的应用并不能完全阻止块茎蛾的产卵与为害。本研究采用核桃叶粗提物对马铃薯块茎蛾成虫进行产卵驱避,驱避率高达86%,且对幼虫钻蛀的驱避率高达90%,这表明利用核桃叶粗提物对成虫和幼虫进行驱避,其效果比单纯驱避成虫要更好。

云南省核桃种植面积大,核桃叶取材方便，价格便宜；核桃叶粗提物对环境没有污染，也不会引起害虫的抗药性,这表明核桃叶粗提物在防控马铃薯块茎蛾上具有较好的应用前景；加之其药效持久,为以后的田间防治带来方便,更为生物农药的广泛使用打下基础。

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