鸡源绿脓杆菌的分离鉴定及药敏试验

2018-04-15贵州省畜牧兽医研究所550005

当代畜禽养殖业 2018年10期

贵州省畜牧兽医研究所 550005

绿脓杆菌又被称作铜绿假单细胞菌，能够导致多种动物的脏器出现脓肿，所以绿脓杆菌可以从伤口的脓液中分离获得。各年龄段的鸡都会受到绿脓杆菌的感染，导致肺炎、心肌炎以及肝周炎等疾病，死亡率高达80%。

1 实验材料

实验样品选取某鸡场送检的4只病死鸡，对其进行剖检，并在无菌环境下采集病死鸡的肝脏与肺脏；实验采用的试剂包括琼脂糖、DL2000DNA Marker、10×Loading Buffer、肠杆菌科、JAMES液以及快速革兰氏染色液等；实验采用的培养基包括血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基等。

2 实验方法

（1）细菌的分离培养。在病死鸡的肝脏和肺脏中分离出细菌，通过划线方法将其接种于麦康凯平板、营养琼脂平板以及血液琼脂平板上，分别将3个平板放置于37℃的条件下培养24小时。然后选取其中的典型菌落，分别设置为1-4号，在典型菌落纯培养的过程中进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌。

（2）细菌的生化实验。根据肠杆菌科相关鉴定试剂盒中带有的说明书，对细菌分离培养中的纯培养物进行生化实验。实验的仪器为ATB自动生化检定仪，明确鸡源细菌的种属。

（3）免疫荧光抗体染色。在载玻片中滴加1滴PBS，并在培养基中挑取单个菌落均匀涂布在载玻片的PBS上，在菌落自然干燥后使用甲醇进行15分钟干燥；再使用PBS冲洗5分钟，共冲洗3次；然后在载玻片上添加一抗，在37℃的条件下孵育30分钟，再使用PBS冲洗之后添加二抗，在37℃的条件下孵育30分钟；最后使用PBS冲洗后使用蒸馏水漂洗，干燥后放置于荧光显微镜下观察。能够产生蓝绿色荧光素以及蓝色绿脓素的细菌为绿脓杆菌。

（4）药敏试验。制作绿脓杆菌的肉汤培养物，根据Kirby-Barer氏法，在营养琼脂平板的表面均匀涂布培养物。使用无菌镊子将20种抗生素的药敏试纸粘贴于培养基表面（需要注意的是，药敏试纸需要等距粘贴），然后将培养基放置于37℃的恒温培养箱中培养18～24小时。培养期间观察并记录试纸上的抑菌圈直径，按照NCCLS（2009）标准进行药敏试验结果分析。

（5）PCR试验。应用细菌纯培养物进行PCR试验，首先将其接种于普通LB液体培养基中，进行24小时培养，然后根据树脂型TM基因组DNA提取试剂盒中带有的说明书，进行分离菌株基因组DNA的提取，进一步鉴定绿脓杆菌。试验采用的上游引物序列为 5’-CCGTGCTTCAGT-TCCAGTGTG-3’，下游引物序列为 5’-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3’。最后根据基因组DNA进行PCR反应，并通过1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，明确PCR产物的序列[1]。