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双翅目昆虫侵袭对荷斯坦奶牛内分泌及免疫机能的影响研究

2018-11-02内蒙古农业大学动物科学学院010018内蒙古农业大学兽医学院010018

当代畜禽养殖业 2018年10期
关键词:内分泌昆虫淋巴细胞

内蒙古农业大学动物科学学院 010018 内蒙古农业大学兽医学院 010018

内蒙古是一个奶牛生产地带,近几年来奶牛的数量不断增长,使奶牛生存的环境卫生日益恶化。常年发生蚊和蝇等双翅目昆虫的侵袭,诱发奶牛应激反应,导致神经内分泌紊乱、免疫力下降和重大疾病流行,使奶牛业的发展受到很大制约[1]。

双翅目昆虫作为奶牛场中的主要应激源,侵袭强度过大或作用时间过长时,奶牛机体就会逐渐失去应付能力,出现病理状态。当机体遭遇冷、热和饥饿刺激时,会同时引起交感神经系统和肾上腺机能增强,表现出交感-肾上腺髓质系统亢进,髓质分泌大量肾上腺素(E)和去甲肾上腺素(NE),引起应激反应[2.3]。有研究表明,奶牛受到长时间的冷热应激后,血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(COR)含量与非应激期相比无显著性差异,甚至有低于非应激期的趋势[4]。大多数研究认为,应激对免疫系统有抑制作用,应激和免疫之间的关系还受性别、年龄和心理因素等个体因素影响[5]。应激时,机体在神经-内分泌-免疫系统协同作用下,进行一系列的免疫调节[6]。所以,应激影响神经-内分泌-免疫网络。

本试验通过研究奶牛受到双翅目昆虫的侵袭时,奶牛内分泌激素及免疫力的变化规律,论证双翅目昆虫侵袭时奶牛的应激反应。为进一步缓解昆虫对奶牛应激的技术措施提供理论依据。

1 材料

(1)试验动物及管理。按胎次、产奶量和年龄相近的原则,以舍饲奶牛场饲养的9头健康荷斯坦奶牛作为试验对象。 牛群挤奶时间为上午 5∶30,下午 17∶30,日挤奶 2 次。饲料给予时间为上午 7∶00~9∶00,中午 13∶30~15∶30,晚上 19∶00~21∶00,共 3 次。 自由采食青干草和饮水。其余时间牛在运动场自由活动或休息。

(2)血样的采集与预处理。每个试验月采1次血液样品,在双翅目昆虫活动最频繁的时间段,用普通真空采血管和抗凝真空采血管颈静脉采集血样,离心分离血清和血浆,带回实验室-20℃保存待检测。

(3)主要试剂。 一抗:CD3 Moab Ascites fluid Ig G1 isotype;CD4 Mo Ab Ascites fluid Ig G1 isotype;CD8 Mo Ab Ascites fluid Ig M isotype;CD21 Moab Ascites fluid Ig M isotype。 二抗:Fluor escein(Fitc)Anti Mouse Ig M;Goat Anti Mouse Ig G1,Iluman ads FITC(一抗与二抗都是PO Box 502,Pullman,WA 99163 USA 公司提供)。

(4)试验器材。离心机(型号为Multifuge)购自美国Thermo Scientific Heraeus公司,酶标仪 (型号为Thermo NANODROP 2000c)购自美国Thermo Scientific Heraeus公司,恒温生化培养箱(型号为ZXSD-B1090)购自上海智城公司,流式细胞仪(型号为FACSSalibur)购自美国BD公司,移液枪(型号为TopPette)购自北京大龙兴创实验仪器有限公司。

2 方法

(1)双翅目昆虫侵袭时奶牛内分泌激素水平的影响。采用酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒法,测定血清中的内分泌激素相关指标。测定的激素指标为促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)、皮质醇(COR)、泌乳素 (PRL)和去甲肾上腺素 (NE),试验步骤按照ELISA试剂盒说明书进行。试剂盒均购自北京城林生物科技有限公司。

(2)双翅目昆虫侵袭时对奶牛免疫机能的影响。采用流式细胞仪测定奶牛外周血淋巴细胞及其亚群的影响。

测定方法:每个管中用移液器移取40uL抗凝血,迅速加入10倍稀释后的800uL溶血素,轻轻震匀,静置12分钟,1500rpm离心400秒,弃上清;加入300μL PBS缓冲溶液,清洗2次,离心后弃上清;加入200uLPBS稀释,然后按(50uL/份)分成 4等份,分别加入淋巴细胞荧光标记CD3/FITC-IgG1、CD4/FITC-IgG1、CD8/FITC-IgM和CD21/FITC-IgM,避光低温孵育30分钟后离心弃上清,再加入200uL PBS,漩涡震荡使细胞悬浮,流式细胞仪上获取10000个细胞,检测其中 CD3+T、CD4+T、CD8+T和 CD21+B细胞的所占百分数。

(3)统计学分析。采用Excel和SAS9.0软件对数据进行统计分析,试验数据用“平均值±标准差”表示。使用方差分析对试验结果进行显著性分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,P>0.05表示差异不显著。

3 结果与分析

(1)双翅目昆虫侵袭时对奶牛内分泌激素水平的影响。双翅目昆虫侵袭对奶牛血清激素水平的影响见表1。从表1可见,双翅目昆虫活动期,奶牛血清中的ACTH含量6月极显著高于7月,显著高于8月和9月,6月和 10月间无显著差异(P>0.05);血清中 COR含量各试验月间差异显著(P<0.05),但是从6月以后,至7月和8月份有下降趋势,9月开始回升;血清中GH含量6月极显著高于7月和8月,显著高于9月,但与10月差异不显著(P>0.05);血清中PRL含量6月显著高于7月和8月(P<0.05),但是9月和10月无明显差异(P>0.05);血清中NE含量7月显著高于6月、9月和10 月(P<0.05),与 8 月间差异不显著(P>0.05)。

表1 双翅目昆虫侵袭时奶牛血清中激素水平的变化

(2)奶牛血液淋巴细胞的变化。奶牛血液中淋巴细胞(%)水平见表2,奶牛血液淋巴细胞(%)分析图见图1~图4。由表2可知,双翅目昆虫的侵袭对荷斯坦奶牛血液CD3+T淋巴细胞(%)水平的影响规律是从 6月 74.63±7.21%显著下降至7月55.29±1.76%,一直持续到 10 月 50.82±1.49%的水平(P<0.05);血液 CD4+T淋巴细胞(%)水平的影响规律是从6月59.21±2.10%显著下降至7月40.75±2.14%,一直持续到10月33.87±3.46%的水平(P<0.05);血液 CD8+T 淋巴细胞(%)水平的影响规律是从6月13.05±0.89%显著提高至 7月35.73±1.14%,一直持续到9月21.09±1.19%的水平(P<0.05),10 月下降至 15.07±1.65%,与 6 月相比差异不显著(P>0.05);奶牛血液 CD21+B 淋巴细胞(%)水平的影响规律是从6月29.44±1.22%显著下降至8月23.64±1.59%,而从9月显著提高至34.45±2.15%的水平(P<0.05),持续至 10 月。

表2 奶牛血液淋巴细胞变化(%)

图1 奶牛血液CD3+T淋巴细胞(%)的二维点阵

图2 奶牛血液CD4+T淋巴细胞(%)分析图

图3 奶牛血液CD8+T淋巴细胞(%)分析图

图4 奶牛血液CD21+B淋巴细胞(%)分析图

4 讨论

(1)双翅目昆虫侵袭对荷斯坦奶牛血液内分泌激素水平的影响。应激时糖皮质激素的分泌加强是通过下丘脑-垂体前叶-肾上腺皮质轴(HPA)相互作用而实现的。大量研究表明,机体发生急性应激反应时增高HPA轴兴奋性,从而促进ACTH释放,引起长时间的皮质醇水平升高,使有生物学活性的游离皮质醇有充分的时间作用于靶器官,增强或抑制靶器官的功能[7]。但是随着应激时间的延长,皮质醇浓度会逐渐降低,甚至低于基础浓度,说明皮质醇的合成在逐渐减少。皮质醇在体内参与机体的应激反应,并调节三大代谢,是维持许多组织器官正常活动所必需的,具有抗炎和抗免疫等作用[8-9]。西伯利亚鲟热应激初期时血清皮质醇含量迅速升高,之后快速回落[10]。本试验结果表明,双翅目昆虫开始侵袭的6月,奶牛血清中ACTH和COR水平较高,而在双翅目昆虫频繁侵袭的7月,奶牛血清中ACTH和COR水平下降,一直持续至9月,与上述研究结果较一致。由此认为,在双翅目昆虫活动期,特别是双翅目昆虫频繁侵袭奶牛时期,对奶牛内分泌产生一定的影响,长期昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中ACTH和COR的水平具有抑制作用。

GH主要的生理功能是促进物质代谢和生长发育,还参与机体的应激反应。运动、饥饿及应激侵袭均可引起GH分泌增多。PRL主要的生理作用是促进乳腺的发育并维持泌乳。应激状态下,血液中PRL与ACTH和GH的浓度同时增加,共同参与应激反应。吕晓伟[4]的研究表明,冷热应激期间奶牛血清中GH和PRL的含量显著低于非应激期。本试验结果也证实,双翅目昆虫开始侵袭的6月,奶牛血清中GH和PRL水平较高,在双翅目昆虫频繁侵袭的7月,奶牛血清中GH和PRL水平下降,一直持续至9月。由此认为,在双翅目昆虫活动季节,特别是双翅目昆虫频繁侵袭奶牛时,对奶牛内分泌产生一定的影响,长期昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中GH和PRL的水平具有抑制作用。当机体受到强烈侵袭时,就会出现以交感神经兴奋、儿茶酚胺分泌增多的一系列神经内分泌反应,以适应强烈侵袭,提高机体抗病的能力。应激可以促使交感神经和肾上腺髓质活动的加强,使血液中NE水平升高[11]。本试验结果表明,在双翅目昆虫频繁侵袭的7月和8月,奶牛血清中NE水平明显提高,9月开始下降。由此推测为,在双翅目昆虫频繁侵袭奶牛期间,昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中NE水平具有促进作用。

(2)双翅目昆虫侵袭对奶牛细胞免疫及体液免疫力的影响。研究者认为,一些动物实验及人体观察证实,长期冷应激对免疫功能的影响主要是抑制性的[6]。目前已知CD3分子能够表达于全部T细胞上,是T细胞共同的表面标志,因此它是鉴定T细胞的重要标记,CD3+T淋巴细胞降低提示细胞免疫机能降低或受抑制。CD4存在于辅助性T细胞表面,CD8存在于细胞毒性T细胞表面。CD4+T细胞含量高时,当外源性病原微生物侵入体内时能够很快启动免疫反应,从而抵抗病原,表明机体免疫功能强,不易被疾病感染。CD8+T细胞含量高时,能识别被感染的细胞越多,表明机体本身的免疫功能降低,需要外来疫苗来抵抗病原。CD21+B淋巴细胞代表机体体液免疫力的强弱,CD21+B淋巴细胞降低,机体体液免疫力下降或受到抑制。应激侵袭可降低大鼠血液中CD3和CD4细胞的百分率,而CD8百分率提高,说明产生应激时大鼠细胞免疫功能降低[12]。慢性冷热应激期CD3+T淋巴细胞(%)和CD21+B淋巴细胞(%)都显著降低,使奶牛的免疫能力下降[13]。本研究结果表明,在双翅目昆虫活动季节,双翅目昆虫的侵袭对奶牛血液CD3+T、CD4+T和CD21+B淋巴细胞(%)水平的影响是从6月的最高下降至7月和8月的最低值,CD3+T和CD4+T一直持续到10月。同时,双翅目昆虫的侵袭对奶牛血液CD8+T淋巴细胞(%)水平的影响是从6月提高至7月的最高值,持续到8月。由此认为,CD3+T和CD4+T淋巴细胞降低表明双翅目昆虫的侵袭,会降低或抑制奶牛细胞免疫机能。CD8+T细胞含量的提高,能识别被感染的细胞越多,表明双翅目昆虫的侵袭,降低奶牛机体本身的免疫功能,需要疫苗来抵抗病原。CD21+B淋巴细胞降低表明双翅目昆虫的侵袭,能降低或抑制奶牛机体体液免疫力。

综上所述,在双翅目昆虫活动期,特别是双翅目昆虫频繁侵袭奶牛时期,对奶牛HPA轴产生一定的影响。而且长期昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中ACTH、COR、GH和PRL的水平具有抑制作用,而对奶牛血清中NE水平具有促进作用。双翅目昆虫的侵袭,能够降低或抑制奶牛细胞免疫机能及体液免疫力。同时降低奶牛机体本身的免疫功能,需要疫苗来抵抗病原。

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