新生猪源沙门氏菌耐药性及耐药基因的研究

2018-04-15沈阳工学院生命工程学院113122

当代畜禽养殖业 2018年10期

沈阳工学院生命工程学院 113122

1 材料与方法

（1）材料。菌株来源：2017年6月～2017年10月抽取某养殖场150份新生猪猪肉样品；药敏质控菌沙门氏菌C79-13及阳性对照菌株。试剂：PCR试剂（北京百泰生物技术有限公司），实验所需引物系自主合成，药敏纸片（北京兰博瑞生物技术有限公司），具体包含庆大霉素、复方新诺明、链霉素、环丙沙星、氯霉素、壮观霉素、四环素、诺氟沙星、阿米卡星以及萘啶酸共10种。仪器：DYY-70型号电泳仪、TGL-16G台式离心机、DHP-9048型号恒温培养箱等。

（2）方法。将采集的150份新生猪猪肉样本逐一置于灭菌袋内，加入培养基共同保存。新生猪猪肉样本保存时间不得超出12小时。

细菌分离方法。将样本置于含BPW培养液的无菌密封袋内保存，于37℃条件下摇床过夜。第二天，吸取1mL BPW前增菌液至改良肉汤半固体培养基表面，置于42℃恒温箱内持续培养24小时。培养后从培养基中挑取白色可疑菌落，采用三区划线法进行处理，于37℃条件下继续培养24小时。采用PCR鉴定法鉴定疑似沙门氏菌，以Stn的核苷酸序列设引物。PCR反应条件为：94℃5min预变性处理，保持温度不变，预变性45s后转为55℃条件，持续退火45s；调整至72℃延伸30s，经过30个循环。最后于72℃条件下持续延伸10min。电泳方法选用琼脂糖凝胶，电泳后回收DNA胶，所得产物用于DNA测序。标本血清型鉴定选用玻片凝集法，新生猪源沙门氏菌的药敏试验采用K-B法进行。

2 结果

（1）新生猪源沙门氏菌鉴定结果。本组150份新生猪猪肉样本经改良肉汤半固体培养基、XL74培养基两轮筛选后，分离出24株可疑沙门氏菌（表面可见黑色中心，而且周围可见透明晕环菌落）。经PCR鉴定（Stn基因）及电泳产物回收测序后，确定21株沙门氏菌。新生猪源沙门氏菌的分离率为14.00%。

（2）新生猪源沙门氏菌的血清型鉴定结果。21株新生猪源沙门氏菌中，共鉴定出6种血清型，其中肠炎沙门氏菌分离率最高，占比25.14%，其他优势血清型包含徳尔卑血清型（21.25%）和里森沙门菌（13.62%）。

（3）新生猪源沙门氏菌的耐药性。21株新生猪源沙门氏菌的10种抗生素药敏分析结果显示，分离菌对10种抗菌药物的耐药性各不相同：新生猪源沙门氏菌对氯霉素（72.45%）、庆大霉素（68.26%）和壮观霉素（65.28%）的敏感性较高，而对环丙沙星（98.75%）、链霉素（94.23%）和阿米卡星（87.69%）表现为高耐药。其中，3株新生猪源沙门氏菌仅耐1种药物，而18株新生源沙门氏菌耐2种以上抗生素。

（4）新生猪源沙门氏菌的耐药基因。本组10种耐药基因中，有5种经PCR扩增出相应大小的目的片段。其中，磺胺类耐药基因包含sulII和sulI两种，后者检出率最高，为45.62%；喹诺酮类耐药基因以parC为主，检出率为97.46%；氯霉素耐药基因floR为47.26%。

3 讨论

沙门氏菌抗原性复杂，耐药性强，沙门氏菌感染为猪安全养殖及食物污染控制带来诸多不便。为了评估新生猪源沙门氏菌的耐药性及耐药基因，本研究将150份新生猪猪肉标本作为研究对象，结果表明：150份猪肉样本中共分离出21株沙门氏菌，分离率为14.00%。新生猪源沙门氏菌对不同抗生素的耐药程度各不相同，其中高耐药主要包含环丙沙星（98.75%）、链霉素（94.23%）和阿米卡星（87.69%），而3株新生猪源沙门氏菌仅耐1种药物，其余18株新生源沙门氏菌耐2种以上抗生素。这一结果表明新生猪源沙门氏菌的耐药现象较为明显。

PCR结果显示：磺胺类耐药基因sulII、sulI（45.62%），喹诺酮类耐药基因parC （97.46%），氯霉素floR（47.26%）。通过对耐药性及耐药基因的对比发现，新生猪源沙门氏菌的耐药性与耐药基因存在密切关联。