非洲猪瘟研究现状

张 博

(抚顺市动物疫病预防控制中心，辽宁抚顺 113006)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是家猪和野猪感染的一种病毒性传染病，其病原是能够引起猪出血热的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus ,ASFV)。根据ASFV的特性、临床症状和感染途径，该病分为能够长期持续性感染的慢性感染和病死率达100%的急性感染。高致病性ASFV毒株感染的临床表现包括高热、精神沉郁、皮肤发绀、食欲废绝、出血性病变和共济失调，并伴有严重的血小板和淋巴细胞减少，感染动物通常在感染后10 d～14 d内死亡[1]。

ASF在非洲大陆的猪群中流行传播已有几十年，而且殃及到西班牙、葡萄牙、法国和意大利等欧洲国家的猪群，但在20世纪90年代中期，除了撒丁岛，该病在欧洲的其他国家已被净化[2]。虽然撒丁岛采取了与西班牙和葡萄牙等欧洲国家相类似ASF净化措施，但是由于当地的社会文化、经济发展和生产因素使ASF在撒丁岛的净化效率受到影响[3]。2007年，ASF通过高加索地区，特别是格鲁吉亚，重新传入欧洲大陆，并由此传播到亚美尼亚、俄罗斯、白俄罗斯、乌克兰以及波兰和立陶宛[4-5]。由于疫苗和抗病毒药物的缺乏，非洲猪瘟对所有欧洲国家构成了严重的威胁。

尽管世界各国对ASFV疫苗进行了深入研究，但目前并未产生疫苗可以有效地预防ASF的全球性传播。本文旨在介绍当前ASFV疫苗和抗病毒药物的研究现状，总结了过去几十年来对有效疫苗开发的研究成果。此外，还讨论了如抗病毒化合物等其他替代方法，该类化合物由于ASF全球化威胁性的日益严重而备受关注。同时，重点介绍了疫苗开发和抗病毒药物研究的一些先进观点。

1 疫苗

大多数病毒疫苗都采用两种不同的制备方法，即病毒灭活和病毒弱化。其中，灭活疫苗的主要缺点是，由于物理或者化学因素灭活，导致疫苗产生免疫反应的时间不长，与此相反，弱毒疫苗能够引起强烈且长时间的免疫反应[6]。目前，可以采用基因敲除、反向遗传学和基因重组等策略提高弱毒疫苗的有效性[7]。

生产安全有效的ASFV疫苗始于20世纪60年代中期，当时研究人员发现通过细胞传代培养的弱化ASFV可以诱导产生猪源抗体，而且同源性ASFV无法对血清中带有该抗体的猪引发急性病变。据报道，将感染ASFV的戊二醛固定的肺泡巨噬细胞，进行细胞声波破碎后，再免疫给猪，这些猪在受到强毒株感染时，会加速血清学反应[8]。此外，猪感染无红细胞吸附力的非致死性ASFV之后，表现出对高致病毒株ASFV/l60的抗性增加，并在感染的情况下存活了下来，且没有明显改变。猪在免疫接种无毒性的OURT88/3毒株之后，再用关系密切的强毒株OURT88/1加强免疫，可以诱导产生对同一基因型Ⅰ的不同分离株进行交叉保护[9]。由此可以看出，虽然用一个强毒株进行加强免疫不能确保其完全的安全性，但是可以产生具有交叉保护的ASFV疫苗，从而扩大了疫苗接种的方式以及应用范围。

研究表明，用现代佐剂制备的灭活ASFV可以在猪的体内诱导出ASFV特异性抗体。虽然所有的动物都可以产生ASFV特异性抗体，但并没有观察到明显的免疫保护作用[10]。由此可见，ASFV特异性抗体并没有显示其中和活性。然而，大量的证据表明，猪源抗体可以在体外中和各种ASFV强毒株的传染性，而中和活性的丧失取决于ASFV在细胞系中的增殖,并且ASFV的低传代株和高传代株在中和反应的敏感性上存在差异[11]。

对抗原及其表位的识别可以引起强烈的免疫反应，从而开发有效的ASFV疫苗。通过研究发现了一些抗原，比如ASFV特异的细胞毒性T淋巴细胞可以识别并裂解表达ASFV p30和p72蛋白的细胞[12]。不同的病毒蛋白在ASFV复制的过程中发挥的作用不同，因此p30蛋白的抗体抑制细胞内超过95%ASFV内在化，而p72和p54蛋白的抗体能够抑制病毒附着。通过对p32蛋白和p54蛋白的进一步研究发现，虽然重组p30或p54蛋白可以使猪产生免疫诱导中和抗体，但按照该方法免疫不能保护急性ASF感染的猪。相比之下，p30和p54这两种蛋白的结合体或嵌合体可能会诱导产生对ASFV感染的局部保护[13]。但也有研究显示，杆状病毒表达的p30、p54和p72免疫依然不能够使猪免受ASFV感染。以上结果表明，这些蛋白质的抗体不足以形成完全免疫[12]。事实上，新的研究已经发现细胞毒性T淋巴细胞在对抗ASFV时起到了重要的保护作用，而带有衰亡的细胞毒性T淋巴细胞的猪对ASFV的感染并没有保护作用。但具有可诱导细胞毒性T淋巴细胞发生免疫应答的以DNA融合质粒和杆状病毒为载体的疫苗，能够对ASFV的侵袭发挥部分保护作用，从而证实细胞毒性T淋巴细胞在疫苗开发中的重要性[11]。由于上述研究的灭活苗、弱毒苗或者亚单位疫苗都不能对实验感染的猪进行全面保护，因此，在未来的研究里仍需要研发有效的疫苗。

2 抗病毒药物

在没有抗ASFV疫苗的情况下，价格合理的抗病毒化合物可产生非常有效的作用，因为合理应用抗病毒药物可延长宿主的存活时间，并使受感染的猪产生对ASFV的有效免疫反应。同时，在已经感染养殖场附近地区采取抗病毒治疗，能够对感染地区进行隔离，给管理者提供足够的时间采取对抗病毒感染的措施。

基于抑制机理的不同，潜在的抗ASFV化合物可分为两类：一类是在复制周期直接作用于ASFV的抑制剂；另一类是针对参与病毒复制的宿主细胞因子抑制剂。ASFV的复制周期包括病毒附着、内在化、基因组增殖、子代病毒的组装和释放等几个步骤。能够直接或间接地阻断这些步骤之一的特异性药物可以成为抑制ASFV感染的潜在工具。

一些研究讨论过干扰ASFV早期感染阶段的药物。研究发现，硫酸多糖会影响ASFV的附着和随后的复制，这是因为由带负电荷的硫酸盐基团在病毒包膜上与带正电的氨基酸相互作用而抑制病毒附着在细胞上。依赖巨胞饮和网格蛋白的内吞作用是ASFV入侵的下一个步骤，细胞膜上的胆固醇与此相关，因此，胆固醇去除剂如甲基-β-环糊精可抑制病毒复制[11]。阿米洛利是潜在的巨胞饮抑制剂，也可以导致明显的ASFV侵入降低[14]。综上所述，这些结果表明，依赖巨胞饮和网格蛋白的内吞过程可以作为ASFV入侵的替代或协同机制。溶酶体药物，如氯化铵、金刚烷胺、氯喹和甲胺，阻断了内体酸化，而内体酸化是ASFV成功感染的必要条件，从而明显抑制了病毒的复制。

在过去的几十年，发现了针对ASFV酶的抗病毒药物。利福霉素衍生物可以抑制依赖DNA的RNA聚合酶和Ⅱ型DNA拓扑异构酶。系统遗传学研究发现，Ⅱ型DNA拓扑异构酶与细菌的DNA旋转酶和Ⅳ型DNA拓扑异构酶相类似，这说明抗菌的拓扑异构酶抑制剂可能干扰ASFV的复制。事实上，喹诺酮类抗菌药物，可以通过抑制Ⅱ型DNA拓扑异构酶干扰ASFV的复制周期[15]。

核苷类似物是主要的抗病毒药物，通过与病毒核酸的结合或干扰病毒的聚合酶和核糖核苷酸还原酶等关键酶来抑制病毒的复制。不同的核苷类似物对ASFV的体外活性存在差异。与其他的核苷类似物相比，环-9-(3-羟基-2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤和碳环3-去氮杂腺苷有更高的抗ASFV活性[16]。此外，在病毒吸附前添加以抗肿瘤活性而闻名的没食子酸十二酯，可以观察到其抑制细胞和病毒DNA的合成和后期的病毒转录，具有显著抑制ASFV的复制的抗病毒效果。

植物是抗病毒治疗中许多药理反应的天然产物的来源。海洋微藻的提取物，如紫球藻和后棘藻所产生的硫酸化多糖可以通过剂量依赖型模式抑制ASFV的体外复制。在原代细胞培养中，钩枝藤的提取物和碎片具有抗ASFV的活性[17]。此外，多酚植物抗毒素如白藜芦醇和氧化白藜芦醇可以通过抑制病毒DNA复制和后期病毒蛋白合成来显著降低ASFV的增殖[4]。 虽然以上提到的化合物都具有很好的抗ASFV活性，但缺乏关于体内试验活性的证据。因此，需要开展更深入的体内研究，证实这些化合物可能是治疗ASFV感染的潜在药物。

3 展望

ASFV基因的识别将成为ASFV疫苗发展的切入点，靶基因的缺失可降低病毒毒力或增加免疫应答的强度。两种相反的方法可以用来鉴别靶基因：一是敲除参与ASFV侵袭和免疫逃避的非必需基因，从而产生弱毒株；二是敲除对ASFV复制至关重要的基因，使之不能够在免疫过的猪体内进行复制。一些ASFV基因可以作为敲除目标基因的候选基因，例如敲除参与编码核苷酸代谢酶的ASF基因，包括胸苷激酶和参与病毒形态变化的ERV 1同系物，这些酶可以参与巨噬细胞中的病毒复制[18]。相比之下，删除一些其他参与免疫逃避的基因虽然并不能降低ASFV的毒性，但这些基因的缺失有助于产生有效的疫苗。例如，病毒蛋白A238L抑制宿主转录因子NF-κB和NFAT，以及转录激活蛋白CBP和p300，从而影响这些因素所控制的免疫调节基因的转录激活[19]。此外，ASFV编码的2个基因CDv2和EP153R，可以分别抑制受感染细胞的识别和对MHCⅠ类多肽的表达[16,20]。由于这些蛋白可能会干扰宿主的免疫反应，因此从弱毒和强毒的ASFV株中敲除相应基因可能会增强免疫反应。

虽然将由基因敲除毒株产生的重组ASFV疫苗接种给猪，可以防止其被亲本病毒感染，但是敲除其他基因并不会诱导猪产生保护性免疫[18,21]。因此，需要通过进一步的研究来确定最合适的靶向敲除基因。此外，猪接种天然弱毒苗之后会出现发烧等不良反应[22]，基于这种现象，研究者还需要了解关于使用ASFV弱毒株诱导发生保护性免疫反应时，避免副反应发生的相关知识。

目前已知，欧洲野猪的数量与包括发生在高加索和俄罗斯联境内的几次ASF暴发有关。因为，野猪能够通过直接接触家猪、摄入污染物和被感染的尸体促进该病的传播，从而使对ASFV的控制措施变得更加复杂[8]。在ASF流行地区免疫口服苗可能是一种可行的控制措施，这种方法被证实可以有效地控制动物结核和伪狂犬病等疾病[23]，因此，应将口服苗作为野猪免疫的候选疫苗，并对其进行适用性评估。

此外，通过对ASFV复制周期和致病机制中涉及的过程进行研究可以为抗病毒药物的设计提供新的指向，例如，近年的研究发现，ASFV利用了网格蛋白依赖的内吞作用和巨胞饮作用来感染宿主细胞[24]。两种机制都需要病毒和宿主细胞膜的融合以达到成功感染，而这两层膜的融合是热感的，它具有非常高的动能屏障，病毒融合蛋白可以通过减少各种动能屏障来加速膜融合过程[24]。基于对ASFV融合蛋白结构的分析，该蛋白可能有助于以融合蛋白为靶向的抗病毒药物的发现。此外，高通量筛选方法可识别抗ASFV化合物，这些化合物可通过生物化学或生物物理机制来增加动力学屏障，从而抑制ASFV与宿住细胞膜的融合。

ASFV关系到猪养殖业的巨大经济效益，因此解决ASFV问题刻不容缓。虽然目前已经对实验疫苗、细胞培养的弱毒苗或转基因试验产生的重组苗都进行了研究和评估，但尚未研发出具有高免疫原性和全面免疫保护效果的疫苗。因此，坚持研究ASFV与宿主细胞的相互作用，会给疫苗研制和抗病毒药物的研究提供新的思路。即使不能完全的消灭ASF，单独使用疫苗或将疫苗和抗病毒药物联合使用将减弱ASFV的致病性。