肿瘤相关巨噬细胞M1型极化在肿瘤治疗中的作用研究进展

田佳丽，刘晓波*

(1.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000)

识别针对肿瘤免疫应答的细胞和分子抑制剂是肿瘤免疫学领域的研究热点，将为恶性肿瘤的免疫疗法提供新的靶标[1]。恶性肿瘤和其他疾病有所不同的是，它较易复发和转移，但也可促进部分免疫细胞在肿瘤微环境中大量积累，其中肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)就是肿瘤微环境中主要的免疫细胞[2]。巨噬细胞是肿瘤微环境中关键的炎性细胞[3]，按照表型可分为M1、M2两种表型，且肿瘤微环境中以M2型居多，呈现出免疫抑制效应，而不是具有抗肿瘤作用的M1型。但有研究报道，M2型可以逆转为M1型，从而发挥抗肿瘤作用。因此，可给予相应的化合物、抑制剂，也可阻断部分信号通路等，有针对性的调控巨噬细胞表达M1型，是极具应用前景的肿瘤治疗新策略。

1 肿瘤相关巨噬细胞简介

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是一类在肿瘤微环境中存在的重要炎性细胞，研究表明许多肿瘤组织特别是上皮组织，如大肠、肺、乳腺、胃的实体瘤内含有大量的免疫细胞浸润[4]，以巨噬细胞为主，占30%～50%。巨噬细胞从未成熟的单核细胞通过细胞因子募集，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、集落刺激因子-1(colony-stimulating factor-1，CSF-1)和趋化因子(chemokine，CCL-2)等，这些单核细胞迁移到肿瘤组织并分化成肿瘤中的TAM。当病变进展为恶性肿瘤后，巨噬细胞通过类似的机制不断招募。丁惠[5]研究中采用免疫组化法检测得出所增加的TAMs可能来源于宫颈癌附近的巨噬细胞迁移至肿瘤组织中，从而发生定向迁移。大量的数据表明,肿瘤起始、进展和转移受巨噬细胞表型动态变化的影响。首先，巨噬细胞是具有高度表型和功能异质性的免疫细胞群体，在所有组织中广泛分布，且巨噬细胞在宿主对感染的天然免疫应答中起主要作用。此外，巨噬细胞在体内平衡、组织修复和发育中的作用得到了广泛的认可[6]。在肿瘤起始期间，TAM可产生诱变和促进其生长的炎症环境，可释放大量血管生成因子VEGF和PDGF等，以时间和空间方式将VEGF和其他血管生长因子递送到无血管区域，导致血管生成[7]。通过分泌生长因子来增强肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。其中，TAM还可通过介导免疫抑制、抑制效应T细胞的增殖或将更多的Th2等募集到肿瘤组织，而达到抑制抗肿瘤免疫的目的。TAM在肿瘤微环境中根据巨噬细胞的激活状态、肿瘤细胞的内在特点[1]，以及肿瘤的发展阶段和类型发挥相应的功能。因此，如何调控巨噬细胞的表型，已成为近年的研究热点。

2 肿瘤相关巨噬细胞的表型

在长期肿瘤微环境下，肿瘤相关巨噬细胞分为经典活化(M1)和替代性活化(M2)型2种。首先，经IFN-γ和LPS等信号活化得到M1型，主要具有抗肿瘤和增强免疫的作用，能分泌炎症因子、趋化因子、效应分子和TNF-ɑ等，其中以膜分子CD16、表面标记CD32等为代表。其次，经IL-4和IL-13等因子活化得到M2型，主要具有抑制免疫反应、促进血管发生、组织修复和促进肿瘤生长的潜能，更多地分泌IL-10、TGF-β、VEGF等因子，以CD163和CD206相对高表达[8]。

有研究报道了TAM在转录水平上可能以M2亚型居多，Topf M C等[9]通过对患有喉鳞状细胞癌的颈部淋巴结兼转移性前列腺癌患者的治疗中采用HE染色后发现，病灶部位高表达CD163，且浸润的M2型巨噬细胞数量较多，促进肿瘤的生长和转移。并且有研究报道[10]通过评估485个临床标本中不同表型巨噬细胞的分布，得出在CRC中M1巨噬细胞的浸润伴有M2型，并进一步提出可通过分析免疫细胞的位置、密度和功能取向，以及患者的预后问题，来探究出有效的治疗方法。不过，Gratchev A等[11]在研究中发现肿瘤微环境中，TAM的两种表型M1、M2会发生转变，其M2型能被逆向极化为M1型TAM，从而激发机体产生特异性抗肿瘤免疫应答，该极化过程具有可逆性和可调节性[12]。所以，在未来的肿瘤免疫治疗中，可根据治疗的目的，按需要有效地调控巨噬细胞的表型，操控其激活模式，从而达到治疗的目的，这已经成为重要的肿瘤治疗策略。

3 激活巨噬细胞的抗肿瘤效应

3.1 新型免疫增强剂MBP

麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)是大肠埃希菌麦芽糖转运系统的重要成员，能够与麦芽糖结合，主要负责麦芽糖的摄取和分解代谢；也能与重组蛋白融合，促进纯化并增强融合蛋白的稳定性，从而诱导肿瘤细胞的免疫应答[13]。MBP也可作为新型的免疫增强剂，能有效地诱导TAM发生极化，从而发挥免疫应答的作用。Wang Wan等[14]研究发现，当用MBP刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞时，经对其M1型巨噬细胞特异性标记物的NO、IL-1β、IL-6、CD80以及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表达的检测，结果表明MBP能诱导活化并增强RAW264.7巨噬细胞的M1型极化。试验论证了MBP能通过调控巨噬细胞的极化类型而发挥抗肿瘤的作用，但就其抗肿瘤作用机制尚不明确，但这为未来在免疫治疗中有望将MBP作为免疫佐剂而提供理论基础和应用前景。

3.2 免疫调节剂多糖

多糖可活化机体免疫细胞，调节白介素和肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌，在机体抗肿瘤免疫调节等方面备受关注，是目前常用的免疫调节剂。江泽波等[15]用IL-4诱导Raw264.7巨噬细胞株，建立的M2亚型模型，给予猪苓多糖干预后可检测出M1型特异性指标iNOS mRNA明显升高，M2特异性指标CD206表达率降低，说明其可逆转M2型为M1型，从而发挥机体免疫调节、抗肿瘤作用。相关研究报道[16]猪苓多糖可以通过TLR4信号通路活化巨噬细胞，刺激TNF-α、IL-1β等炎症因子分泌，发挥抗肿瘤的作用，但其作用机制尚未明确。

褐藻多糖作为一种天然硫酸多糖化合物，萃取自褐藻细胞壁。多项研究表明，褐藻多糖具有良好的抗肿瘤、抗炎症、降血脂、抗氧化等生物学功能[17]，其抗肿瘤作用主要通过抑制肿瘤细胞生长和肿瘤细胞因子分泌等。目前，就褐藻多糖体内外抗肿瘤作用的研究主要集中于下调细胞周期蛋白、活化caspases家族蛋白以促进肿瘤细胞的死亡、增加NK、T淋巴细胞的活性和数量、抑制粘附分子以降低其转移的能力。而Sun Jia等[18]研究发现，褐藻多糖通过NF-κB的途径而显著抑制M2型趋化因子CCL22的表达，并进一步抑制M2型巨噬细胞介导的肿瘤细胞的迁移，特别是Treg细胞的募集，从而发挥抗肿瘤作用。

通过对猪苓多糖和褐藻多糖抗肿瘤作用的研究，发现还存在很多的化合物可以通过调控肿瘤相关巨噬细胞的表型，来发挥其抗肿瘤的作用，这一发现，为今后肿瘤的免疫疗法提供新的研究策略和方向。

3.3 信号通路抑制剂

Notch信号是一条调控细胞分化与发育高度保守的信号通路。近年报道中发现在实体瘤中，Notch信号通过调节巨噬细胞的激活模式来调节其功能状态。若能特异性阻断Notch信号通路，表达TAM的M1型就可发挥其抗肿瘤作用。

其中，Xu J等[19]报道了Notch信号通路一方面上调M1型极化基因表达，另一方面通过诱导丙酮酸脱氢酶磷酸酶、丙酮酸脱氢酶活性以及葡萄糖进入三羧酸循环促进葡萄糖氧化磷酸化和ROS形成以进一步增强M1型极化基因的表达；Zheng Shaoping等[20]报道在血吸虫感染鼠模型中浸润肝组织的巨噬细胞显示M2功能极化，且在体内外Notch1/Jagged1信号显著上调。当用γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路，可逆转体外的巨噬细胞M2偏振，减轻血吸虫病鼠模型中的肝肉芽肿和纤维化。所以，通过阻断巨噬细胞Notch信号通路，来调控巨噬细胞的极化状态，发挥抗肿瘤或对其他疾病的治疗作用将成为新的研究策略。

程序性死亡分子1(programmed death 1，PD-1)/PD-1配体(PD-1 ligand， PD-L1)作为一个重要的免疫抑制分子，主要表达在APC细胞和某些肿瘤细胞表面。其中，PD-L1是PD-1的主要配体，在很多恶性肿瘤中高表达，包括肿瘤浸润巨噬细胞。Pardoll D M[21]研究发现激活PD-1与PD-L1的结合，会抑制肿瘤微环境形成，并使得肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤。而用PD-1/PD-L1抑制剂阻断该通路，能逆转肿瘤免疫微环境，达到增强内源性抗肿瘤免疫效应。目前，PD-1/PD-L1抑制剂药物是首个被FDA批准用于非小细胞肺癌的免疫治疗药物，同时也广泛用于其他肿瘤的治疗，也取得一定的成效。其中，宗兆运[22]研究发现，体外刺激巨噬细胞得到M1、M2样巨噬细胞上清，作为条件培养基刺激小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞，通过对相应的信号通路的检测，得出M1型TAM可促进免疫抑制分子PD-L1的上调表达。另外，Harada K[23]研究发现对GAC样品中的PD-L1、CD68和CD163(M2型巨噬细胞)进行免疫组织化学染色，结果发现M2型巨噬细胞浸润与GAC细胞中的PD-L1表达高度相关，提示巨噬细胞浸润可作为潜在的治疗靶点。Burmeister K[24]在研究150例CRC和45个相邻非恶性组织样本的石蜡包埋样本时采用免疫组化对CD68(M1/M2巨噬细胞标记物)和CD163(M2巨噬细胞标记物)进行检测，也观察出了高级肿瘤中M2巨噬细胞数量增加和PD-L1肿瘤表达增加。这些研究提示，可以设计小分子药物来阻断免疫抑制分子PD-L1的过量表达，进而提高肿瘤的治疗效果，这为抗肿瘤研究提供了新的方向。

4 M2型巨噬细胞的表型转换

4.1 IL-6特异性抑制剂激活素A和重组人IL-6逆转M2极化

白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)是一种多效性细胞因子，可刺激免疫系统对损伤作出反应，参与恶性肿瘤的增殖和自身免疫性疾病的发生[25]，还参与了机体多种功能，其中与肿瘤的发生发展密切相关。近年报道肿瘤相关巨噬细胞TAM在肿瘤微环境中过度表达IL-6，也证实了IL-6能诱导巨噬细胞向M2型极化，参与恶性肿瘤的免疫逃逸，是恶性肿瘤预后不良的重要标志[26]。而IL-6特异性抑制剂激活素A能有效的抑制IL-6的产生，从而发挥抗肿瘤转移的作用。Ohno Y等研究[27]也发现与野生型小鼠相比，IL-6缺陷型小鼠的肿瘤生长明显降低，并进一步推测出在荷瘤宿主中因IL-6缺乏增加了抗肿瘤效应T细胞的诱导，并抑制体内肿瘤发生。王青山等[28]在研究中发现共培养小鼠M1型巨噬细胞RAW264.7与乳腺癌细胞4T1中加入IL-6特异性抑制剂激活素A，能以剂量依赖的方式有效抑制IL-6，使M2型巨噬细胞的比例明显下降。初步证实通过阻断IL-6能在一定程度上遏制M1型巨噬细胞向M2型转化。刘苗[29]通过将小鼠巨噬细胞系Raw 264.7细胞和骨髓瘤细胞系KM3细胞共培养，予以ACTA(IL-6特异性抑制剂激活素A)或rIL-6(重组人IL-6)处理后，结果表明激活素A(IL-6特异性抑制剂)能抑制Raw 264.7细胞向M2型巨噬细胞转化，重组IL-6能促进上述转化过程。

此外，促进巨噬细胞-M2极化的诱导因子还有IL-1、IL-4、IL-10、IL-13、IL-34、CSF和TNF-α等细胞因子。这些因子通过激活STAT信号通路促进TAM-M2极化[30]。因此，通过抑制上述因子的产生，能在一定程度上减少M2型的含量，而发挥抗肿瘤作用。

4.2 抗肿瘤小分子化合物伊马替尼

伊马替尼(Imatinib)是小分子化合物，也是酪氨酸激酶抑制剂。目前，其研究方向主要集中于转移性胃肠间质癌，但近期在临床报道中提出了Imatinib干预肿瘤转移的研究，张洁琼[31]用小分子化合物Imatinib对巨噬细胞增殖的影响以及条件培养基对小鼠肺癌细胞的影响，通过流式细胞术、RT-PCR方法、Transwell小窒细胞迁移试验、Western blot技术和细胞免疫荧光的方法检测了肿瘤的转移，发现Imatinib通过抑制STAT6的磷酸化以及入核，抑制巨噬细胞M2型极化而对Ml型极化无明显影响，从而发挥抗肿瘤转移的作用。所以，可用小分子化合物有效地抑制巨噬细胞M2型极化，而达到抗肿瘤作用的目的。

4.3 其他途径逆转M2极化

有研究报道人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)Nef蛋白能有效地逆转M2极化，Porcheray F等[32]在探讨巨噬细胞活化与HIV感染关系的研究中也发现，感染HIV病毒的巨噬细胞其表面的CD163、CD206及另一种选择性活化的巨噬细胞标志CCL18均被抑制，进一步证明巨噬细胞向促炎性的M1巨噬细胞转化。Maizumi K等[33]研究将CD40L基因转染到小鼠肺癌细胞中，通过癌细胞表达的CD40L刺激肺泡巨噬细胞表面的CD40分子，使得巨噬细胞的NO、TNF、IL-12以及IFN-γ表达增加，但在缺乏CD40的小鼠肺泡巨噬细胞中未见表达。所以，CD40-CD40L与巨噬细胞的相互作用促进了M1巨噬细胞表型细胞因子的产生，提示肿瘤组织中表达的CD40-CD40L可以逆转M2型巨噬细胞为M1表型。

Guiducci C等[34]将荷瘤小鼠中CCL16寡集的巨噬细胞观察到肿瘤组织浸润的巨噬细胞表达高水平的IL-10，不表达TNF及IL-12，表明肿瘤浸润的巨噬细胞为M2表型。荷瘤小鼠注射Cp G-DNA以及IL-10受体抗体6 h后，对TNF与IL-12的表达及NO的含量检测结果表明，注射Cp G-DNA和IL-10受体抗体后，小鼠TNF、IL-12及N0的产生量远高于单一成份注射组和未注射组，证明Cp G-DNA联合IL-10受体抗体在一定程度上有逆转巨噬细胞表型的作用。

5 展望

巨噬细胞是肿瘤微环境中关键的炎性细胞，有M1、M2两种表型，其中，M1型主要具有抗肿瘤和增强免疫的作用。从绝大多数报道中均可以得出如果能够调控巨噬细胞的表型及其作用机制，这将成为抗肿瘤研究的新方向，不仅对肿瘤的发生发展有明显的作用，还为肿瘤的免疫疗法打开一个新视野、新策略，是极具应用价值的新靶标。此外，通过MBP、多糖类、特异性阻断Notch信号通路等多种途径均能调控巨噬细胞表达M1型，发挥抗肿瘤的作用，而通过IL-6特异性抑制剂激活素A和重组人IL-6、小分子化合物伊马替尼(Imatinib)等来抑制其向M2型转化，可发挥抗肿瘤转移的作用，还可通过给予HIV-1 Nef蛋白、肿瘤组织中表达的CD40-CD40L、Cp G-DNA联合IL-10受体、双磷酸盐来逆转M2型巨噬细胞为M1表型。巨噬细胞是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，其可塑性高，在组织重塑，炎性反应和抗肿瘤免疫反应等过程中扮演着重要的角色。目前，对于抗肿瘤作用的研究多采用免疫疗法，相比传统疗法中的手术切除、化疗等，其副作用小，可调动机体的免疫系统，增强肿瘤免疫力。但目前因存在肿瘤生物学差异，TAMs在肿瘤微环境中存在的数量、表型、作用等可变和相关预后等问题，使得将巨噬细胞作为免疫疗法的新靶标而遇到瓶颈。不过，有效调控肿瘤相关巨噬细胞M1型极化与其他免疫治疗手段相联合应用，是肿瘤治疗上极具研究前景的发展方向。我国应加速开展在化合物、信号通路、受体、细胞因子及蛋白等抗肿瘤领域的各项研究，并有针对性的调控巨噬细胞的表型，将TAM作为治疗肿瘤的靶细胞为抗肿瘤研究提供新的方向和见解。