荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌脱氧核糖核酸诊断肺结核的价值

吴淑红 荣福 欧阳雁弟

【摘要】 目的 探討荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）结核分枝杆菌脱氧核糖核酸（TbDNA）诊断肺结核的临床价值。方法 选取51例肺结核患者作为肺结核组， 另选60例非肺结核患者作为对照组。所有患者均完善BALF TbDNA检测及毛刷涂片抗酸染色镜检、痰涂片抗酸染色镜检。以评价BALF中TbDNA检测对诊断肺结核的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）。结果 荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA， 其阳性对肺结核诊断的敏感性、特异性、PPV、NPV分别为74.51%、96.67%、95.00%、81.69%， 肺结核组毛刷涂片抗酸染色镜检的敏感性为13.73%， 痰涂片抗酸染色镜检敏感性为15.69%。对照组中， 荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA的特异性为96.67%， 毛刷涂片抗酸染色镜检及痰涂片抗酸染色镜检的特异性均为100.00%。肺结核组荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA与痰涂片抗酸染色镜检及毛刷涂片抗酸染色镜检敏感性比较差异有统计学意义（P<0.05）。对照组荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA与毛刷涂片抗酸染色镜检及痰涂片抗酸染色镜检的特异性比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA有良好的特异性和敏感性， 有望辅助传统的检查来早期诊断肺结核。

【关键词】 荧光定量聚合酶链反应；支气管肺泡灌洗液；结核分枝杆菌脱氧核糖核酸；肺结核

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.10.007

【Abstract】 Objective To disucss the clinical value of fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） in detection of mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid （TbDNA） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods There were 51 pulmonary tuberculosis patients as pulmonary tuberculosis group， and 60 non-pulmonary tuberculosis patients as control group. All patients improved BALF TbDNA detection， brush smear acid-fast staining， sputum smear acid-fast staining， so as to evaluate the sensitivity， specificity， positive predictive value （PPV） and negative predictive value （NPV） of TbDNA detection in BALF for diagnosis of tuberculosis. Results TbDNA in BALF was detected by fluorescence quantitative PCR， and the sensitivity， specificity， PPV and NPV of the positive pulmonary tuberculosis were 74.51%， 96.67%， 95% and 81.69% respectively. In the pulmonary tuberculosis group， the sensitivity of brush smear acid-fast staining was 13.73%， and the sensitivity of sputum smear acid-fast staining was 15.69%. In the control group， the specificity of fluorescence quantitative PCR for detection of TbDNA in BALF was 96.67%. The specificity of brush smear acid-fast staining and sputum smear acid-fast staining were 100.00%. In the pulmonary tuberculosis group， there was statistically significant difference in sensitivity of TbDNA in BALF detected by fluorescence quantitative PCR， comparing with sputum smear acid-fast staining and brush smear acid-fast staining （P<0.05）. In the control group， there was no statistically significant difference in specificity of TbDNA in BALF detected by fluorescence quantitative PCR， comparing with brush smear acid-fast staining and sputum smear acid-fast staining （P>0.05）. Conclusion Fluorescence quantitative PCR shows good specificity and sensitivity in detection of TbDNA in BALF， and it is expected to assist traditional examination in the early diagnosis of pulmonary tuberculosis.

【Key words】Fluorescence quantitative polymerase chain reaction； Bronchalveolar lavage fluid； Tuberculosis deoxyribonucleic acid； Pulmonary tuberculosis

结核病是一个全球性的卫生问题， 据世界卫生组织统计， 其仍然是全世界的首要传染病杀手， 2013年全球有900万人患结核病， 其中死亡150万人， 且近年来在世界范围内出现流行， 呈增长的趋势[1]。控制结核病的关键在于早发现， 早隔离和治疗活动性肺结核[2]。结核病可累及全身多脏器， 但以肺结核最为常见。目前肺结核的病原学检查方法主要包括培养和涂片， 但培养费时， 涂片阳性率低， 且肺结核的临床症状多不典型， 且缺乏特征性的影像学表现， 因此， 部分肺结核患者无法得到早期诊断， 甚至出现漏诊和误诊。荧光定量PCR检测与常规的检查方法比较， 敏感度高， 特异性强， 可以检测1～100 fg纯化结核分枝杆菌DNA（约相当于1～20个

结核分枝杆菌菌体的DNA量）[3]。肺泡灌洗液直接取材于远端气道及肺泡腔， 细菌含量高， 应用荧光定量PCR方法检测BALF中的TbDNA， 能辅助传统的方法早期诊断肺结核患者。本文收集2016年5月～2017年11月本科收治的51例肺结核患者及60例非肺结核患者， 所有患者均完善

BALF TbDNA检测及支气管镜刷检涂片抗酸染色镜检、痰涂片抗酸染色镜检， 以评价荧光定量PCR检测BALF中TbDNA诊断肺结核的价值。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 收集2016年5月～2017年11月本科收治的51例肺结核患者作为肺结核组， 肺结核按照《肺结核诊断和治疗指南》诊断[1]， 平均年龄（48.18±17.17）岁；其中男26例， 女25例。另选60例通过相关检查及治疗排除肺结核感染的肺部疾病患者作为对照组， 平均年龄（52.13±

18.01）岁；其中男30例， 女30例；细菌性肺炎35例， 真菌性肺炎2例， 支气管扩张症15例， 肺癌5例， 脓胸2例， 气胸1例。两组患者的一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 检测方法

1. 2. 1 肺泡灌洗液收集， 常规气管镜下见异常者或者于胸片及胸部CT提示相关病灶的对应叶段支气管行灌洗， 无菌灌洗液瓶收集BALF约20 ml， 密闭， 立即送检， 取5 ml行荧光定量PCR法检测TbDNA， 检测值≥5.0E+2为阳性， <5.0E+2为阴性。

1. 2. 2 气管镜下行经支气管镜防污染刷检， 涂片送抗酸染色。

1. 2. 3 所有患者痰标本均于漱口后留取晨痰， 进行抗酸染色后镜检， 其中抗酸染色镜检找到结核分枝杆菌为阳性， 未找到结核分枝杆菌为阴性。

1. 2. 4 试剂均采用中山大学达安基因股份有限公司生产的TbDNA试剂盒， 严格按照试剂盒的操作规程进行检验。

1. 3 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA， 其阳性对肺结核诊断的敏感性、特异性、PPV、NPV分别为74.51%、96.67%、

95.00%、81.69%， 肺结核组毛刷涂片抗酸染色镜检的敏感性为13.73%， 痰涂片抗酸染色镜检敏感性为15.69%。对照组中， 荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA的特异性为96.67%， 毛刷涂片抗酸染色镜检及痰涂片抗酸染色镜检的特异性均为100.00%。肺结核组荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA与痰涂片抗酸染色镜检及毛刷涂片抗酸染色镜检敏感性比较差异有统计学意义（P<0.05）。对照组荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA与毛刷涂片抗酸染色镜检及痰涂片抗酸染色镜检的特异性比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

3. 1 肺结核是目前临床上最常见的慢性传染性疾病之

一[4]， 探索早期、快速及准确的肺结核诊断方法是目前结核病研究的重点。通常在肺结核诊断中， 痰和肺泡灌洗液、浆膜腔积液检测结核杆菌属于最为可靠的检查方法， 分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂类， 不易着色， 但若经延长染色时间及加温后， 则不易被酸性脱色剂脱色， 根据这一原理， 临床上疑似肺结核患者进行痰涂片找抗酸杆菌检查， 操作简便， 快速， 是临床广泛应用的肺结核诊断方法之一[5]。但本研究显示， 痰涂片抗酸染色镜检方法对于肺结核诊断的敏感性仅为15.69%， 与刘洁等[6]及姜广路等[7]研究相似。其敏感性与排菌量及痰标本收集是否恰当等有非常大的关系， 而且达到5000～10000 ml浓度才能得到阳性结果[8]， 同时本研究发现， 气管镜下毛刷涂片抗酸染色镜检的敏感性仅为13.73%， 所以， 痰及毛刷抗酸染色镜检无法满足临床早期诊断的要求。

3. 2 在全国肺结核流行病调查当中， 痰菌呈阴性的肺结核患者占总的结核病患者的60%～70%， 在实际临床应用中， 痰菌出现阴性但通过临床综合资料确诊肺结核的患者占70%～

80%[9]。近年来， 随着分子生物学的迅速发展， 分子生物学技术如荧光定量PCR逐步应用于肺结核的诊断中。荧光定量PCR技术具有高敏感性、高准确性， 定量范围广、操作简便、快速安全， 是污染最少的DNA体外扩增技术[10]。目前， 该技术广泛应用于检测痰标本、外周血及肺泡灌洗液当中， 特别是对于无空洞型、病变范围较少的含菌量低的标本。肺泡灌洗液直接取材于远端气道及肺泡腔， 其接触病灶的范围较广， 细菌含量高， 污染几率较低， 同时， 灌洗时可刺激患者咳嗽， 有利于局部支气管分泌物的引流。本研究显示， 通过荧光定量PCR检测肺泡灌洗液TbDNA的敏感性、特异性、PPV、NPV分别74.51%、96.67%、95.00%、81.69%， 其敏感性显著高于痰涂片找抗酸杆菌、气管镜下毛刷涂片找抗酸杆菌， 与张红漫等[11]及魏巍等[12]研究相似。荧光实时PCR技术检测BALF中的TbDNA的结果一般1 d内获得， 对诊断肺结核具有快速、敏感、特異的特点， 是一种值得临床推广的方法[13]。

3. 3 荧光定量PCR检测BALF中的TbDNA的敏感性、特异性分别为74.51%、96.67%， 假阴性的原因包括不同人群免疫水平存在差异[6]、标本内含有大量Taq酶抑制因子抑制了PCR扩增[14]及部分病例所感染的结核分枝杆菌存在IS6110序列的缺失[15]等。本研究肺结核组共13例患者， 全部患者病程均<4 周， 其中， 9例在完善检查前曾使用二线抗结核用药“左氧氟沙星针”， 假阴性可能与病程较短及受到药物影响有关。本研究在对照组中， 2例患者出现假阳性， 考虑可能与以下原因有关：①标本间的污染、标本对试剂的污染[11]；②实时定量PCR检测TbDNA不能区分死菌还是活菌， 因此在一些非结核感染病灶及一些陈旧结核灶也有可能出现假阳性[16]；③扩增了患者体内潜伏感染的结核分枝杆菌[14]。对病情的判断仍应该结合其他检查结果综合判断。

综上所述， 采用荧光定量PCR方法检测BALF中的TbDNA不仅快速， 而且敏感性、特异性高， 灌洗更是有利于局部支气管分泌物的引流， 对肺结核特别是影像学特征不典型及痰涂片检查阴性的患者， 是一种可以提高确诊率有效方法之一， 其结果可以作为肺结核的主要诊断依据指标及筛选指标。同时， 可以协助肺结核的早期诊断， 值得临床推广。以后， 作者将对该检查对肺结核患者的疗效进行动态观察， 以了解其对抗结核药物的使用指导意义。

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[收稿日期：2017-12-04]