Neuropilin-1在结肠癌中的表达及其与预后的关系

王辉 谢荣俊 刘龙飞 李峰

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，随着生活方式及饮食结构的改变，其发病率逐年升高，虽然结肠癌5年生存率较高，但其高复发性及远处脏器转移是最主要死因。神经纤毛蛋白-1（Neuropilin n-1,NRP-1）为血管内皮生长因子(VEGF)的一种新型细胞受体，参与多种恶性肿瘤的发生及转移[1]。本研究分析Neuropilinns-1在结肠癌中的表达情况及其与预后的关系，旨在为结肠癌诊治提供理论依据。

1　材料与方法

1.1一般资料 收集2011年9月～2012年3月我院胃肠外科手术结肠癌患者石蜡切片58例，所有患者具有完整临床资料及随访资料。男36例，女22例，年龄31～86岁。按照第七版AJCC/UICC的标准TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期15例，Ⅲ期43例。对入选患者采用书信和电话进行随访，随访时间3～32月，以患者出院为随访起点，死亡或最后随访时间为终点，终止随访时间为2014年10月30日。

1.2实验方法 免疫组织化学检测NRP-1蛋白的表达，石蜡切片脱蜡，3%H2O2阻断过氧化物酶，抗原修复，血清封闭，上NRP-1一抗，4℃过夜，上二抗温育，加抗生物素蛋白工作液，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、固定。以PBS作为对照物，细胞浆、细胞膜或者细胞核呈现浅黄色、黄色、棕褐色分别为弱阳性、阳性、强阳性。图像分析：20倍显微镜下计算随机100个阳性细胞灰度值的平均值（背景灰度值-实测灰度值），灰度值越小，颜色越深。兔抗人NRP-1单克隆抗体购于美国Novus公司，二抗及免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行分析，以±s表示计量资料，采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析；计数资料用百分比表示，采用χ2检验，生存分析使用Kaplan-Meier法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1免疫组化检测结肠癌中NRP-1蛋白的表达情况 NRP-1主要表达于细胞胞浆内，结肠癌细胞异性明显，核分裂明显，见图1、2。结肠癌组织中NRP-1蛋白表达明显高于癌旁组织，见表1。

图1　癌旁组织中NRP-1蛋白的表达（S P×200）

图2　结肠癌中NRP-1蛋白的表达（S P×200）

表1　结肠癌及癌旁组织中 NRP-1蛋白的表达（±s）

表1　结肠癌及癌旁组织中 NRP-1蛋白的表达（±s）

组织 NRP-1 表达 NRP-1阳性[n(%)]结肠癌组织 138.17±9.05 39（67.24）癌旁组织 92.42±7.81 7（12.07）t/χ22.46418.445 P 0.017 0.016

2.2生存分析 Kaplan-Meier生存分析结果显示，NRP-1阳性表达患者的32月生存率明显低于阴性表达患者（χ2=6.832，P=0.009），见图 3。

图3　NRP-1阳性及阴性表达结肠癌患者生存率曲线图

3　讨论

NRP-1最初研究多数集中在神经系统和心血管疾病中，近年来，NRP-1被发现在多数恶性肿瘤中高度表达而逐渐被重视。Ding[2]在小细胞肺癌中发现NRP-1与肿瘤密切相关，并且NRP-1可能介导肿瘤的浸润及转移，具体途径可能为参与肿瘤血管生成。国内学者李明[1]在胃癌中也发现，NRP-1主要表达在肿瘤细胞膜和细胞质内，与正常胃黏膜组织相比，胃癌组织NRP-1表达明显升高，同时发现其表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关，并且发现与VEGF也密切相关，由此推断NRP-1可能扮演VEGF受体角色，参与肿瘤血管的生成，从而介导胃癌的发生与发展。本研究结果显示，结肠癌组织中NRP-1蛋白高度表达，而在癌旁组织为低度表达，说明NRP-1与结肠癌相关，参与结肠癌的发生与发展。生存分析中发现，NRP-1阳性表达结肠癌患者32月生存率明显低于阴性表达患者，更进一步说明NRP-1的高表达参与结肠癌的发生及发展，并导致患者预后不良。

NRP-1可分为膜性NRP-1和可溶性NRP-1，是具有跨膜功能的糖蛋白，位于细胞表面的神经纤维轴突上，能够调节神经细胞导向、轴突生长作用，正常机体中的NRP-1主要在内皮细胞、成骨细胞和骨髓基质细胞等组织表达[3]。可作为受体与多种配体如Sema3、胎盘生长因子2、TGF-β1、bFGF、VEGF和PDGF等结合[4]。研究显示，NRP-1可与VEGF家族中较多的血管生成因子的酪氨酸激酶受体相互作用，从而增强信号转导，促进血管生成，诱发肿瘤的生成，并促进肿瘤的生长。在上皮-间质转化中NRP-1还可以作为启动子，对肿瘤侵袭和进展均发挥重要作用[5]。研究发现，超过98%的NRP-1高表达均来自肿瘤血管，并且其表达水平主要取决于肿瘤组织来源、组织大小和分期程度，还与肿瘤侵袭、转移以及预后不良相关。在各种基质中也有NRP-1的表达，如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞，并被不同的VEGF-A生长因子所激活，从而导致肿瘤进展[6]。因此，NRP-1通过多种途径和因素参与肿瘤的发生，这是因为肿瘤的形成本身就是多种机制参与的“交叉对话”[7]。

综上所述，NRP-1的高度表达与结肠癌密切相关，参与结肠癌的发生及发展，并导致患者预后不佳。因此NRP-1可作为评价结肠癌生物学行为指标之一，并对监测患者生存期具有一定的指导作用，同时，NRP-1也可能对结肠癌靶向治疗具有一定的临床价值。但是，本研究仍有不足之处，如非前瞻性研究，必然可能造成选择性偏倚；实验中缺少结肠正常组织对比，不清楚NRP-1在正常结肠组织中的表达情况；研究只说明NRP-1蛋白在结肠癌的表达和结肠癌患者预后情况，未系统阐明其参与的相关机制，以上这些不足之处将在后续研究中得以补充，以完善本课题研究方案。

1 李明，李强. Neuropilin-1 及VEGF 在胃癌组织中的表达与微血管生成的关系[J]. 中国肿瘤临床，2014，5（41）：332-336

2 Ding M，Liu L，Hu C，et al.Expression of VEGFR2 and NRP-1 in non-small cell lung cancer and their clinical significance[J].Chine J Cancer Res，2014，26（6）：669-677

3 Jubb AM，Strickland LA，Liu SD，et al.Neuropilin-1 expression in cancer and development[J].J Pathol，2012，226（1）：50-60

4 Choi J，Yang ES，Cha K，et al.The Nuclear Matrix Protein，NRP/B，Acts as a Transcriptional Repressor of E2F-mediated Transcriptional Activity[J].Journal of Cancer Prevention，2014，19（3）：187-198

5 Zachary I. Neuropilins： role in signalling，angiogenesis and disease[J].Chem Immunol Allergy，2014，99：37-70

6 Sun J，Wang L，Lou W，et al.NRP-1/shRNA silencing suppresses nasopharyngeal carcinoma cell growth in vitro and in vivo[J].Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2015，50（4）：312-317

7 王辉，牛国梁，张树友，等. 姜黄素对人乳腺癌MDA-MB-231 细胞裸鼠移植瘤放射增敏的作用[J]. 中国癌症杂志，2012，5（22）：342-346