慢性淋巴细胞白血病患者长链非编码RNA RP5-180C18.1的表达及其预后评价作用

邵洋，胡延平，刘勇

（中国医科大学附属盛京医院 1. 检验科；2. 血液研究室，沈阳 110004）

慢性淋巴细胞白血病 （chronic lymphocytic leukemia，CLL） 是成熟样B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴结和脾脏大量蓄积为特征的低度恶性肿瘤。CLL在欧美较为常见，而在我国相对少见。目前对CLL的诊断主要依赖于WHO标准［1］，依据白细胞计数、血涂片免疫表型等对CLL进行诊断，目前CLL治疗参考NCCN指南［2］，需要根据患者年龄、细胞遗传学等分层治疗，预后判断参考RAI和BINET标准［3-4］，这两个传统标准主要依赖于体检及血细胞计数来判断预后，并不能充分满足患者需要。近年来一些分子生物学指标 （IGHV、ZAP70、17p-和11q-等） 也参与CLL的诊断治疗及预后判断［5］。为弥补缺陷，CLL-IPI（CLL international prognostic index） 积分系统纳入了TP53缺失/突变、IGHV突变、血清β2-微球蛋白、临床分期和年龄5个指标辅助CLL患者的预后判断［6］。

长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncR-NA） 是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200 nt的长链非编码RNA分子，它可在多层面上 （表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等） 调控基因的表达［7］。非编码RNA的异常表达可以辅助CLL的诊断及预后分层，已有研究证明，多种miRNA及LncRNA在CLL的发生发展中起到重要作用，miR-155提高BCR受体的敏感性，其高表达预示着较差的预后［8］，而与之相反，miR-150降低BCR受体的敏感性［9］，同时，也有多种lncRNA的下调被认为参与肿瘤的生成，包括HOTAIR、MALAT1和SChLAP1等［10］。本研究前期通过二代测序技术筛选CLL患者中相对于健康人B淋巴细胞中lncRNA的异常表达，结果发现超过20 000种lncRNA存在异常表达，其中RP5-180C18.1存在显著上调 （P＜ 0.001） ，提示RP5-180C18.1可能在CLL的发生发展中起一定的作用。本研究分析RP5-180C18.1的表达，探讨其在CLL诊断及预后判断上的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2006年1月至2017年1月本院血液科就诊的初诊CLL患者，采用样本库中留存的临床废弃骨髓样本60例，其中男性27例，女性33例，中位年龄65岁。并采自30例造血干细胞移植供者骨髓液为健康对照。所有患者经过形态学、免疫分型、细胞遗传学及分子生物学综合确诊，实验室特点见表1，诊断标准参照WHO标准。本实验经过中国医科大学伦理委员会批准 （No. 2016PS352K） 。根据相关分子生物学指标，分别根据IGHV突变、CD38及ZAP70对CLL患者进行分组比较。并对60例CLL患者进行了随访。

表1 CLL患者实验室特征Tab.1 Laboratory features of the chronic lymphocytic leukemia （CLL） and control groups

1.2 方法

1.2.1 试剂及引物：淋巴细胞分离液Lymphoprep（中国达科公司） ，逆转录采用RrimeScript RT reagent Kit 逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司） 。实时采用SYBR Green试剂盒（日本TaKaRa公司） 。引物为RP5-180C18.1，F：GCAGCGTCCAGAGGCTGG，R：GGCAGCGAGGATGCTGAACC；TBP，F：CCACGGTG AATCTGTGCT，R：GGAGTCGTCCTCGCTCTT。

1.2.2 qPCR检测：采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，然后Trizol-氯仿方法提取细胞总RNA，Oligo dT法进行反转录反应，以管家基因TBP为内参，同时进行RP5-180C18.1和TBP的实时反应。实时反应设置3个复孔，得出Ct均值，以正常人为对照，应用ΔΔCt相对定量法分析RP5-180C18.1表达水平的差异。ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct RP5-180C18.1-Ct TBP，2-ΔΔCt即为基因表达差异的倍数。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料采用±s表示。计量资料比较采用独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验，预后分析采用log-rank检验。P＜ 0.05 （双向） 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RP5-180C18.1在不同CLL表型中的表达

结果显示，与健康对照组 （1.894±0.62） 比较，RP5-180C18.1在CLL患者 （12.93±2.98） 表达较高 （P=0.013） 。与突变型CLL患者 （0.505±0.07） 比较，IGHV野生型CLL患者 （4.682±1.08） RP5-180C18.1表达高 （P=0.023） ；与 ZAP70 高表达CLL患者 （0.262±0.04） 比较，ZAP70低表达CLL患者 （1.728±0.42） RP5-180C18.1表达较高 （P= 0.002） ；CD38低表达 （1.162±0.31） 与高表达（2.183±0.67） CLL患者RP5-180C18.1表达差异无统计学意义 （P= 0.206） 。

2.2 RP5-180C18.1表达与CLL分型相关分析

将60例CLL样本根据RP5-180C18.1相对表达量的中位数 （2.863） 进行分组［RP5-180C18.1低表达组 （＜2.863） 和RP5-180C18.1高表达组 （＞2.863）］，分析CLL患者临床特征、分型与RP5-180C18.1表达相关性。结果显示，RP5-180C18.1表达与CLL患者性别、年龄、血红蛋白含量及幼稚淋巴细胞比例无关（P分别为 0.604、0.128、0.133、0.058） ；RP5-180C18.1高表达组CLL患者的白细胞计数较低 （P＜ 0.001） ，血小板含量较高 （P＜ 0.001） 。根据分子生物学特征分组结果显示，RP5-180C18.1表达与CD38表达无关（P= 0.796） ；RP5-180C18.1高表达组CLL患者ZAP70表达率较高 （P= 0.019） ，野生型IGHV比例较高 （P=0.030） 。见表2。

表2 RP5-180C18.1表达与CLL患者临床特征、分型的相关分析Tab.2 Correlation analysis of RP5-180C18.1 expression and the clinical features and phenotyping of patients with chronic lymphocytic leukemia

2.3 RP5-180C18.1表达与CLL患者预后相关分析

对60例CLL患者随访结果显示，中位总生存期 （overall survival，OS） 93个月，中位无进展生存期（progression-free survival，PFS） 75个月。RP5-180C18.1低表达组中位OS 98个月，RP5-180C18.1高表达组中位OS 39个月，两者具有统计学差异 （P= 0.048） ，见图1A，RP5-180C18.1高表达CLL患者OS更短。如图1B所示，RP5-180C18.1低表达组中位PFS 81个月，RP5-180C18.1高表达组中位PFS 25个月，两者具有统计学差异 （P= 0.041） ，RP5-180C18.1高表达的CLL患者PFS更短。RP5-180C18.1高表达组预后相对于RP5-180C18.1低表达组更差。

3 讨论

图1 根据RP5-180C18.1表达量对CLL患者进行的Kaplan-Meier生存分析结果Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of patients with CLL according to RP5-180C18.1 expression

RP5-180C18.1位于1号染色体，编码一段596 bp的转录本，基因 ID为ENST00000413901，本研究发现lncRNA RP5-180C18.1在CLL不同表型中存在差异性表达，并且发现其在CLL诊断及预后判断具有辅助作用。结果显示RP5-180C18.1在CLL患者中相对于健康对照存在高表达，提示RP5-180C18.1有作为检测CLL诊断学标志物的潜力。已有研究证明，lncRNA在肿瘤中存在显著差异性表达，可以作为生物标志物辅助肿瘤检测。有研究［11］证明在患者尿液样本中检测lncRNA PCA3可以比前列腺特异性抗原更敏感更特异诊断前列腺癌。血清中检测rp11-445h22.4发现其在乳腺癌组织中高表达，并且具有92%敏感性和74%特异性，显著优于常规生物标志物 （CEA、CA125、CA153、AFP）［12］。另外，在胃癌患者体液样本中检测lncRNA tincr，ccat2，aoc4p，bancr，linc00857， aa174084和H19发现，这些 lncRNA 可以有效鉴别胃癌患者与健康人，并且可以判断胃癌发展的阶段［13］。需要注意的是，本研究对照组设置相对于实验组在参数 （幼稚细胞比例及血常规） 上存在统计学差异，但这并不违背统计学原理，本研究目的是探索RP5-180C18.1作为CLL生物学标志物的潜力，需要把CLL从健康人中鉴别出来，因此必须采用健康人群作为对照，而幼稚细胞数及血常规指标正是CLL的常见异常。外周血标本来源便捷，临床上最理想的检测标志物采用外周血指标，但是因为标本收集受限，本研究未检测外周血RP5-180C18.1含量，本研究骨髓检测RP5-180C18.1表达可靠，同时期待应用于临床CLL诊断，后续将进一步完善外周血RP5-180C18.1表达检测。

对CLL患者随访分析结果显示，RP5-180C18.1高表达患者具有更差的预后。研究［14］证明lncRNA在肿瘤预后判断起重要作用，lncRNA CCAT2在多种肿瘤 （结肠癌、前列腺癌和甲状腺癌等） 中过表达，并且预示着较差预后。也有研究［15］认为treRNA降低CLL中DNA损伤，其高表达预示着较差预后。本研究发现 RP5-180C18.1在野生型 IGHV和ZAP70高表达CLL患者中表达更高，这是否与RP5-180C18.1高表达CLL患者预后较差有关尚未证实，需进一步研究。研究［16］证明IGHV未突变型或ZAP70高表达CLL患者具有较差预后，这也从另一方面支持本研究结果。

综上所述，lncRNA RP5-180C18.1在CLL中高表达，与CLL侵袭性表型相关，并且其高表达具有较差预后。今后应对RP5-180C18.1表达深入研究，为阐明CLL的发病机制提供科学依据。

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