人激肽释放酶相关肽10 ELISA方法建立及其临床应用

杨帆，陈英剑，吴艳花，胡成进

（1. 锦州医科大学研究生院，辽宁 锦州 121001； 2. 济南军区总医院实验诊断科，济南 250031）

人激肽释放酶 （kallikreins，KLKs） 基因表达一组在调节正常生理功能中具有重要作用的丝氨酸蛋白酶，是近年来发现的一类对肿瘤诊断和预后颇具潜力的标志物家族。该家族共包括15个基因 （KLK1～KLK15） ，分别编码含230个氨基酸的人KLKs相关肽 （KLK1～KLK15）［1］，越来越多的研究［2-5］证明其与肿瘤发生发展具有密切相关性。KLK10基因也称NSE1基因，免疫定位于细胞质，无组织特异性［6］，编码含276个氨基酸的丝氨酸蛋白酶—KLK10［7］，目前研究未发现其蛋白酶活性［8］。研究［9-12］表明KLK10mRNA及相关肽的表达异常与乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关［13-16］，其中CpG岛甲基化导致KLK10mRNA的沉默是肿瘤发生发展的重要环节。国外研究［17］报道KLK10与乳腺癌浸润具有相关性，KLK10的表达缺失可以作为乳腺原位癌发展为浸润性导管癌的指征之一，且出现KLK10甲基化乳腺癌患者比未出现KLK10甲基化患者的预后差［18］，表明KLK10有潜力成为乳腺肿瘤预后的标志物。LUO等［19-20］还发现KLK10与乳腺癌患者三氧苯胺和曲妥珠单抗的个体化治疗具有相关性，可作为其耐药的预测标记物。本研究拟建立KLK10血清学检测方法，进而快速测定血清KLK10含量，为临床和后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组

收集济南军区总医院甲状腺乳腺外科2015年至2016年收治的女性乳腺癌患者血清标本80例，平均年龄 （42±3.7） 岁。参照TNM分期系统和乳腺癌分子分型新方法［18］，分为乳腺导管内癌、浸润性乳腺癌；其中浸润性乳腺癌又分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2-rich 型、三阴型。根据病理学淋巴结转移情况分为转移组和未转移组。同期收集济南军区总医院女性乳腺良性病患者血清标本50例，平均年龄（43±4.1） 岁。乳腺癌患者及乳腺良性病标本均经术后病理学确诊，术前均未进行临床治疗。另收集济南军区总医院女性健康体检血清50例作为对照组，入选标准为既往无乳腺癌等乳腺相关疾病，体检未见其他恶性疾病。平均年龄 （44±5.4） 岁。3组年龄差异无统计学意义 （P＞0.05） ，具有可比性。

研究对象均清晨空腹采血，采集静脉血 （5 mL），3 000 r /min离心5 min分离血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 材料

1.2.1 实验菌/细胞株与动物：Rosetta （DE3） 菌株购自TIANGEN公司；BALB/c小鼠均为SPF级，雌性，6～8周龄，购买于山东大学实验动物中心 （许可证号：SCXK20150008） 。新西兰大白兔，雄性，2.5～3 kg，购买于济南西岭角养殖繁育基地 （许可证号：SCXK20150001） 。

1.2.2 实验主要试剂：弗氏佐剂购自Sigma-Aldrich公司；IMAC Ni-Charged Resin购自美国伯乐BIO-RAD公司；双色预染蛋白质Marker （MP203） ，Bradford蛋白质定量试剂盒购自TIANGEN公司；Protein A IgG纯化试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；Glue B型活化辣根过氧化物酶购自泰天河生物技术有限公司。

1.2.3 实验仪器：全自动酶标洗板机购自上海汇松科技有限公司；低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；恒温金属浴购自博科生物有限公司；超声破碎机购自宁波新芝生物科技有限公司；680酶联免疫检测仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 KLK10重组蛋白制备：将含有KLK10 cDNA序列的pET28a载体导入E.coliRosetta （DE3） 中培养。加入1 mmol/L IPTG在28 ℃诱导8 h后收集菌体，利用超声破碎仪裂解菌体获得裂解上清，采用Ni-NTA亲和层析的方法纯化裂解上清，得到KLK10重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行鉴定，通过Bradford蛋白定量方法检测KLK10重组蛋白浓度。

1.3.2 KLK10单克隆/多克隆抗体制备：采用杂交瘤技术诱生富含KLK10单克隆抗体 （monoclonal antibody，mAb） 的小鼠腹水，利用KLK10重组蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得抗血清［21］。蛋白A纯化柱纯化腹水及抗血清，获得KLK10单克隆/多克隆抗体（polyclonal antibody，pAb） 。

1.3.3 KLK10 ELISA检测方法建立：Clue B型活化辣根过氧化物酶标记KLK10多克隆抗体，7.5 μg/mL KLK10单抗100 μL 4 ℃包被过夜；次日洗涤，洗涤后扣干孔内残留液体；每孔加入含4%牛血清白蛋白（BSA） 200 μL，置37 ℃封闭2 h后洗涤；将浓度为0、3.125、 6.25、 12.5、 25、 50、 100 ng/mL的KLK10重组蛋白和血清样本分别加入包被微孔中，每孔100 μL，每例标本均设置1个复孔，37 ℃孵育1 h后洗涤；将酶标多抗按1∶800的比例稀释，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min后洗涤，去除未结合的酶结合物；向各反应孔内加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺 （3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB） 各50 μL，37 ℃避光孵育10 min；每孔加入2 mol/L 硫酸溶液50 μL终止反应；用酶标比色仪测定各孔在450 nm处的吸光度（A）值；以不同KLK10重组蛋白浓度和相应的A值绘制标准曲线，计算出血清标本中KLK10含量。

1.3.4 KLK10 ELISA检测方法评估： （1） 检测范围，检测下限和标准曲线检测最高值确定检测范围。（2）精密度，将2份不同血清样本同批连续测定8次，得到批内变异系数；将2份不同血清样本按照1次/d连续测定8 d，得到批间变异系数。（3） 特异性，采用建立好的双抗体夹心ELISA检测方法对有可能的其他干扰因素或同源蛋白 （BSA、KLK5、KLK6） 进行检测，观察是否存在交叉反应。（4） 重复性，选择标准曲线范围内的4个浓度 （5、10、15、20 ng/mL） 的KLK10重组蛋白，每个浓度反复测定6次，分析检测方法的重复性。（5） 样品稳定性，将KLK10重组蛋白用PBS稀释至系列浓度，均分成3份，分别放置0、3和6 h后利用本方法检测，根据检测结果分别绘制标准曲线并进行比较。（6） 样品回收率测定，将重组蛋白分别用PBS稀释至2、10、50、100 ng/mL，用本方法对样本进行检测，根据检测得到的OD450值和标准曲线计算出每个浓度的测定值，计算样品回收率。

1.3.5 血清CEA和CA153检测方法：使用罗氏combs 6001全自动电化学发光分析检测仪检测乳腺癌组血清中CEA和CA153的含量。临界参考值分别为CEA 5 ng/mL 和 CA153 25 U/mL［22］。

1.4 统计学分析

应用SPSS 21.0对数据进行统计学分析，所有指标均进行正态性检验，定量资料用±s表示，差异性检验采用两独立样本t检验，定性资料的差异性检验采用列联表 （R×C表） 的χ2检验，当列联表中超过20%的理论频数＜5时采用Fisher确切概率法或似然比。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KLK10原核诱导表达及鉴定

根据SDS-PAGE结果，KLK10原核诱导的最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG在28 ℃条件下诱导8 h。通过SDS-PAGE和Western blotting对KLK10重组蛋白进行鉴定 （图1） ，可见32×103处明显条带，与KLK10重组蛋白分子量一致。KLK10纯化后重组蛋白浓度约为2 mg/mL。

图1 KLK10重组蛋白SDS-PAGE和Western blotting鉴定Fig.1 SDS-PAGE and Western blotting of KLK10 recombinant protein

2.2 pAb和mAb效价与浓度测定

采用间接酶联免疫吸附法测定pAb和mAb的效价，分别以磷酸盐缓冲液、免疫前静脉血清作为对照，测定450 nm处的吸光值，判定P/N≥2.1时的最大稀释度为抗体效价。结果显示，pAb和mAb的效价分别为1∶107，1∶106。通过Bradford蛋白定量方法检测纯化后pAb和mAb的浓度，分别为1.2、10.1 mg/mL。

2.3 确定最佳工作条件

单克隆抗体和酶标多抗的最佳工作条件：单抗包被浓度为7.5 μg/mL，酶标多抗工作浓度为1∶800。

2.4 绘制KLK10蛋白浓度标准曲线

测定KLK10蛋白浓度 （100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 ng/mL） 与其相应的A值绘制标准曲线，见图2。直线回归方程：y=0.008 3x+0.198 3 （R2＞0.99） ，线性范围为0.2～200 ng/mL。

2.5 方法学评价

2.5.1 检测下限：最低检测线是测量出的最低标准品检测浓度±2SD得到的浓度，确定为本方法的检测下限为0.245 ng/mL。

图2 酶联免疫法标准曲线Fig.2 Standard curve of ELISA

2.5.2 精密度：分别检测批内及批间样本来判断该方法的精密度，批内平均变异系数为4%～9%，批间平均变异系数为5%～8%。

2.5.3 特异性：检测发现本检测方法对于KLK10高度同源的KLK5和KLK6的检测结果随着浓度的增高存在波动，但2者的波动并不存在固定的趋势，且反应程度与浓度无关，因此该检测方法与两者无交叉反应。

2.5.4 重复性：6次测定4个浓度 （5、10、15、20 ng/mL） 的KLK10重组蛋白相对标准差，分别为3.24%、4.55%、4.78%、5.69%，证明重复性良好。

2.5.5 样品回收率：检测不同浓度的KLK10重组蛋白，将得出的OD450值代入标准曲线，计算出相应的浓度，计算回收率并进行对比，结果显示样品回收率较好。见表1。

表1 样品回收率测定Tab.1 Determination of sample recovery

2.6 临床应用

2.6.1 定量检测样本血清中KLK10含量：乳腺癌患者、乳腺良性病患者、健康对照组血清中KLK10的检测结果分别为 （0.88±0.45） 、 （1.35±0.56） 、（1.57±0.88） ng/mL，乳腺癌患者血清KLK10含量明显低于乳腺良性患者和健康对照组 （P= 0.025） ，乳腺良性患者和健康对照组比较无统计学差异 （P=0.134） 。根据ROC曲线得到cut-off值为1.48 ng/mL，将KLK10含量低于cut-off值判定为阳性。80例乳腺癌患者中有58例低于阈值，KLK10检测灵敏性为72.5%，特异性为88%，Youden指数 （正确诊断指数）为0.605。

2.6.2 血清 KLK10含量与乳腺癌临床指标相关分析：结果显示，KLK10含量与临床分期相关 （P＜0.05），而与病理学分型以及转移情况不相关 （P＞0.05） ，见表2。

2.6.3 KLK10与乳腺癌常用血清学标志物的比较：结果显示，KLK10对乳腺癌的诊断灵敏性、特异性、准确率以及Youden指数均较高 （表3） ，证明KLK10具有诊断乳腺癌的潜力。

2.6.4 KLK10、CEA、CA153联合诊断的评价：结果显示，不同形式的组合均可提高诊断灵敏性和准确率，联合检测效果更好 （表4） 。

3 讨论

乳腺癌是西方女性最常见的恶性肿瘤，我国发病率和病死率也呈现逐年增高的趋势［23］。目前国内乳腺癌诊断还是依靠影像学检查和病理诊断，两者费用较高，且对患者具有一定的危害。血清学检测是临床早期筛查、治疗、预后判断的常用方法，具有简便、成本低，可长期、动态监测疾病发展等优势。本研究建立了KLK10双抗体夹心ELISA检测试剂盒，并进行了方法学评估，证明该方法灵敏性和特异性较高，精密度、重复性和稳定性较好，可用于KLK10的定量分析。采用本方法检测血清KLK10含量发现，乳腺癌患者血清中KLK10的含量低于乳腺良性病患者和健康对照组 （P＜ 0.05） ，证明KLK10在乳腺癌患者血清中表达降低；浸润性导管癌Ⅰ期和Ⅱ期患者血清中KLK10含量明显高于Ⅲ期患者 （P＜0.05） ，证明KLK10的表达与肿瘤的浸润性有关，随着浸润的深入，表达逐渐受到抑制直至缺失，与此前KLK10mRNA的研究结果一致［24］。经过分析发现血清KLK10含量与乳腺癌的临床分子分型和转移情况之间没有显著性差异 （P＞ 0.05） ，证明血清KLK10的表达与雌激素、孕激素以及HER2+的表达不具有显著相关性 （P＞ 0.05） ，由于本研究纳入的三阴型乳腺癌标本数量有限，因此不能完全确证KLK10不受体内激素调节，仍需加大样本量进行进一步确证。

表2 血清KLK10含量与乳腺癌临床指标的相关性Tab.2 Correlation between serum KLK10 content and the clinicopathological features of breast cancer

表3 KLK10、CEA、CA153血清学标志物评价指标比较 （%）Tab.3 Comparison of detection of serum markers KLK10，CEA，and CA153 （%）

表4 KLK10与乳腺癌常用血清学标志物联合检测的评价 （%）Tab.4 Combined evaluation of KLK10 and common serological markers for diagnosing breast cancer （%）

目前临床上常用的乳腺癌血清标志物为CEA和CA153，研究［25-26］表明CEA和CA153在乳腺癌诊断中具有一定的临床价值，但单独应用于临床诊断时仍具有一定局限性。本研究发现KLK10对乳腺癌的诊断灵敏性、准确率和Youden指数均高于CEA和CA153，证明KLK10有潜力成为乳腺癌的新型血清标志物。联合诊断结果显示，不同形式的组合均可提高诊断灵敏性，且CA153和KLK10联合检测可提高灵敏性。而CEA、CA153和KLK10 3者联合检测的灵敏性、准确率和Youden指数升高幅度并不显著，临床意义不大。

综上所述，KLK10是一种非常有潜力的标志物，对临床乳腺癌的早期诊断和预后判断具有重要意义。

参考文献：

［1］ LUNDWALL A，BAND V，BLABER M，et al. A comprehensive nomenclature for serine proteases with homology to tissue kallikreins ［J］.Biol Chem，2006，387 （6） ：637-641. DOI：10.1515/BC.2006.082.

［2］ SOTIROPOULOU G，PAMPALAKIS G，DIAMANDIS EP. Functional roles of human kallikrein-related peptidases ［J］. Biol Chem，2009，284 （48） ：32989-32994. DOI：10.1074/jbc.R109.027946.

［3］ CLEMENTS JA，WILLEMSEN NM，MYERS SA，et al. The tissue kallikrein family of serine proteases：functional roles in human disease and potential as clinical biomarkers ［J］. Crit Rev Clin Lab Sci，2004，41 （3） ：265-312. DOI：10.1080/10408360490471931.

［4］ DORN J，BEAUFORT N，SCHMITT M，et al. Function and clinical relevance of kallikrein-related peptidases and other serine proteases in gynecological cancers ［J］. Crit Rev Clin Lab Sci，2014，51 （2） ：63-84. DOI：10.3109/10408363.2013.865701.

［5］ SCORILAS A，MAVRIDIS K. Predictions for the future of kallikrein-related peptidases in molecular diagnostics ［J］. Expert Rev Mol Diagn，2014，14 （6） ：713-722. DOI：10.1586/14737159.2014.928207.

［6］ PETRAKI CD，KARAVANA VN，LUO LY，et al. Human kallikrein 10 expression in normal tissues by immunohistochemistry ［J］. J Histochem Cytochem，2002，50 （9） ：1247-1261. DOI：10.1177/002215540205000912.

［7］ LUO LY，GRASS L，HOWARTH DJ，et al. Immunofluorometric assay of human kallikrein 10 and its identification in biological fluids and tissues ［J］. Clin Chem，2001，47 （2） ：237-246.

［8］ LI B，GOYAL J，DHAR S，et al. CpG methylation as a basis for breast tumor-specific loss of NES1/kallikrein 10 expression ［J］. Cancer Res，2001，61 （21） ：8014-8021.

［9］ GRIN A，SAMAAN S，TRIPATHI M，et al. Evaluation of human tissue kallikrein-related peptidases 6 and 10 expression in early gastroesophageal adenocarcinoma ［J］. Hum Pathol，2015，46 （4） ：541-548.DOI：10.1016/j.humpath.2014.12.005.

［10］ JIAO X，LU HJ，ZHAI MM，et al. Overexpression of kallikrein gene 10 is a biomarker for predicting poor prognosis in gastric cancer ［J］.World J Gastroenterol，2013，19 （48） ：9425-9431. DOI：10.3748/wjg.v19.i48.9425.

［11］ KOLIN DL，SY K，ROTONDO F，et al. Prognostic significance of human tissue kallikrein-related peptidases 6 and 10 in gastric cancer［J］. Biol Chem，2014，395 （9） ：1087-1093. DOI：10.1515/hsz-2014-0143.

［12］ LUO LY，BUNTING P，SCORILAS A，et al. Human kallikrein 10：a novel tumor marker for ovarian carcinoma? ［J］ .Clin Chim Acta，2001，306 （1/2） ：111-118.

［13］ ZHANG Y，BHAT I，ZENG M，et al. Human kallikrein 10，a predictive marker for breast cancer ［J］. Biol Chem，2006，387 （6） ：715-721. DOI：10.1515/BC.2006.090.

［14］ 顾平，盛世乐，黄钢. 生物标志物在乳腺癌研究中的应用［J］. 上海交通大学 （医学版） ，2007，127 （11） ：1396-2004. DOI：10.3969/j.issn.1674-8115.2007.11.030.

［15］ EWAN KING L，LI X，CHEIKH SAAD BOUH K，et al. Human kallikrein 10 ELISA development and validation in breast cancer sera ［J］. Clin Biochem，2007，40 （13/14） ：1057-1062. DOI：10.1016/j.clinbiochem.2007.05.008.

［16］ YUNES MJ，NEUSCHATZ AC，BORNSTEIN LE，et al. Loss of expression of the putative tumor suppressor NES1 gene in biopsy-proven ductal carcinoma in situ predicts for invasive carcinoma at definitive surgery ［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2003，56 （3） ：653-657.

［17］ GOLDHIRSCH A，WOOD WC，COATES AS，et al. Strategies for sub-types-dealing with the diversity of breast cancer：highlights of the St. Gallen international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2011 ［J］. Ann Oncol，2011，22 （8） ：1736-1747. DOI：10.1093/annonc/mdr304.

［18］ KIOULAFA M，KAKLAMANIS L，STATHOPOULOS E，et al.Kallikrein 10 （KLK10） methylation as a novel prognostic biomarker in early breast cancer ［J］. Ann Oncol，2009，20 （ 6） ：1020-1025.DOI：10.1093/annonc/mdr733.

［19］ LUO LY，DIAMANDIS EP，LOOK MP，et al. Higher expression of human kallikrein 10 in breast cancer tissue predicts tamoxifen resist-ance ［J］. Br J Cancer，2002，86 （ 11） ：1790-1796. DOI：10.1038/sj.bjc.6600323.

［20］ 阮贝鸿. 探索乳腺癌细胞系中曲妥珠单抗耐药相关的生物标志物［D］.杭州：浙江大学，2016.

［21］ 丁洁，何杨，杨剑锋，等. 双抗体夹心ELISA测定人血浆可溶性血管内皮钙黏蛋白方法的建立及其应用研究 ［J］. 中国实验血液学杂志，2017，25 （2） ：562-566. DOI：10.7534/j.issn.1009-2137.

［22］ BABLOK W，PASSING H，BENDER R，et al. A general regression procedure for method transformation. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry，PartⅢ［J］. Clin Chem Clin Biochem，1988，26 （11） ：783-790.

［23］ TORRE LA，BRAY F，SIEGEL RL，et al. Global cancer statistics 2012 ［J］. CA Cancer J Clin，2015，65 （2） ：87-108. DOI：10.3322/caac.21262.

［24］ LIU XL，WAZER DE，WATANABE K，et al. Identification of a novel serine protease-like gene，the expression of which is down-regulated during breast cancer progression ［J］. Cancer Res，1996，56 （14） ：3371-3379.

［25］ 赵晶，刘红，张爱敏，等. 乳腺癌患者血清可溶性肿瘤标志物的临床价值研究 ［J］. 中国肿瘤临床，2008，35 （24） ：1411-1414.DOI：10.3969/j.issn.1000-8179.2008.24.010.

［26］ 朱丽娜. 乳腺癌几种常用肿瘤标志物的研究意义［J］. 世界最新医学信息文摘，2015，15 （71） ：43. DOI：10.3969/j.issn.1671-3141.2015.71.025.