猪流行性腹泻病毒检测方法研究进展

2018-04-12湖北三峡职业技术学院农学院湖北宜昌443000

当代畜禽养殖业 2018年12期

湖北三峡职业技术学院农学院（湖北宜昌） 443000

刘风光长阳土家族自治县动物卫生监督所（湖北宜昌） 443500

李先富宜昌市月亮石牧业有限公司（湖北宜昌） 443000

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的，可导致猪呕吐、水样腹泻、脱水和仔猪高致死率为特征的高度接触性消化道传染病。该病一年四季均有发生，但是多发生于冬春季节。1971年该病首次报道于英国，随后许多国家相继报道[1]，我国于1976年发现该病[2]，各日龄的猪均可感染PEDV发病，其中哺乳仔猪受到的危害最严重，给生猪养殖造成了巨大的经济损失[3,4]。分子生物学检测方法以检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点已经广泛应用于细菌及病毒病的检测，并展示出了良好的应用前景。本文就目前国内外PEDV检测的分子生物学方法的最新研究进展进行综述，为猪流行性腹泻的诊断和防控提供参考。

1 巢式PCR检测方法

刘琪等研究人员[5]根据GenBank中猪流行性腹泻病毒（PEDV）的基因序列分别设计2对引物，在完成最佳条件的筛选、特异性和敏感性试验的基础上，建立了一种快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR检测方法。建立的PCR快速检测方法能够分别对PEDV疫苗毒株和野毒株扩增出特异性片段，片段大小分别为774bp和150bp。该方法对传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒(RV)、猪瘟病毒（HCV）和伪狂犬病病毒（PRV）则不能扩增出特异性片段。该方法具有快速、灵敏、特异和通用等特点，可用于实验室的快速诊断、分子流行病学的调查和野毒株的分离鉴定。

2 多重RT-PCR检测方法

秦毅斌等[6]根据GenBank中PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，设计合成2对特异性扩增引物，通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型，建立了检测不同PEDV毒株类型的双重RT-PCR鉴别检测方法，该方法中PEDV变异毒株能同时扩增出234bp和826bp2条目的条带，PEDV经典毒株只能扩增出1条234bp的目的条带，弱毒疫苗株只能扩增出1条185bp的目的条带，该方法检测A群猪轮状病毒（PRoVA）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪嵴病毒（PKV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪细环病毒（TTV）均为阴性，能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl，该方法检测91份临床腹泻样品，变异毒株阳性感染率为62.64%（57/91），经典毒株阳性感染率为3.30%（3/91），弱毒疫苗株阳性率为4.40%（4/91）。该多重RT-PCR鉴别检测方法能够特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株，可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的临床快速鉴别检测和流行病学调查。

施开创等[7]针对PEDV的S基因和ORF3基因序列设计3对特异性引物，经过反应条件的优化，建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株和疫苗株的三重RT-PCR方法，该方法中能够同时扩增出429bp和198bp者为经典株，能够同时扩增出274bp和198bp者为变异株，能够同时扩增出429bp和148bp者为疫苗株。该方法利用3对特异性引物实现了在同一个扩增反应中鉴别检测PEDV3种不同毒株的目标，为PEDV变异毒株的鉴别诊断与流行病学调查提供了可靠的技术手段。

颜邦斌等[8]为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的方法，试验采用特异性试验、敏感性试验和临床应用等方法对鉴别诊断PEDV变异毒株的一步法双重RT-PCR方法进行了研究。结果表明∶该方法对PEDV变异毒株能够扩增出大小为870bp和543bp的2条特异性条带，对PEDV经典毒株和疫苗株均只能扩增出大小为543bp的1条特异性条带；对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪瘟病毒 (CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV－2)均无任何扩增条带；对变异毒株、经典毒株、疫苗株的检测灵敏度分别达0.75ng、0.80ng、0.09ng的RNA含量。用该方法检测136份猪腹泻病料样品，共检测出阳性样品72份，其中变异毒株阳性样品65份，变异毒株阳性率达47.79%，与基于S基因单重RT-PCR方法和基于ORF3基因单重RT-PCR方法的符合率均为100%。说明双重RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性和敏感性，操作简单，可以准确、快速鉴别诊断出PEDV变异毒株。

3 RT-LAMP检测方法

环介导等温核酸扩增 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术依赖6条特异引物和1种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异和高灵敏地扩增靶序列。逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)是在原反应液中加入一定量的逆转录酶，可以实现RNA的一步扩增。田野等[9]建立起RT-LAMP技术，对实验室送检的40份仔猪腹泻病料进行检测，同时使用常规RT-PCR方法和胶体金试剂盒进行检测并比较试验结果。RT-LAMP的阳性检出率30%要比胶体金试剂盒检测(10%)和PCR(12.5%)高。而且该技术的最大优点就是无需精密的仪器，操作简单快捷，因此适合中小型猪场对病原的快速诊断。

4 TaqMan荧光定量PCR检测方法

桑益旸等[10]基于猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的 N 基因，建立了 PEDV的TaqMan探针RT-PCR检测方法。以标准质粒绘制log10拷贝数与Ct之间标准曲线的线性相关系数值为0.996，检测灵敏度为100拷贝/μl，对传染性胃肠炎病毒的检测结果均为阴性，批内和批间的变异系数均小于1%，表明该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。对不同代次细胞培养上清液中的病毒样品进行检测，结果表明该方法能够满足PEDV野毒株分离过程中的病毒定量检测需要。

5 病毒抗体ELISA检测方法

赵玉龙等[11]为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平，以纯化的PEDV作为包被抗原，优化ELISA反应条件，建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法。当血清OD（450nm）值＞0.31时，判定阳性；当 OD（450nm）值小于 0.26时，判定阴性；当 OD（450nm）值介于两者之间判定可疑。结果表明，试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。孙冰等[12]以原核表达的猪流行性腹泻病毒AH2012株N蛋白为包被抗原，通过条件优化建立了一种快速的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。利用该ELISA检测猪流行性腹泻病毒血清时为阳性，而与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒，猪圆环病毒2型、猪呼吸道冠状病毒的阳性血清均无交叉反应；批内和批间重复性试验的变异系数均小于5.55%；该方法与中和试验检测结果总符合率为88.75%。本研究建立的方法可以应用于我国猪流行性腹泻病毒的诊断、流行病监测以及疫苗研发时抗体水平的检测，为该病的防控提供一种有效的检测工具。

6 实时荧光RPA等温检测方法

吕继洲等[13]基于PEDV病毒M基因保守序列，设计一系列扩增引物及其荧光探针，以包含PEDV病毒M基因片段的PUC57质粒为模板，同时以包含猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒 2型（PCV2）及古典猪瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列的质粒作为对照，建立了一种PEDV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法，测定了方法的特异性与敏感性。结果表明，该实时荧光RPA方法可在39℃恒温反应20分钟。特异性扩增PEDV病毒M基因，与TGEV、PRRSV等对照病毒基因无交叉反应，其检测限为10拷贝/μl。应用该实时荧光RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的实时荧光RPA检测方法简单、快速、灵敏度高，可为PEDV的检测防控提供一种新的、可靠的技术支持。

7 实时荧光定量RT-PCR检测方法

杨峰等[14]为建立了一种特异、灵敏、量化、快速的猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测方法，设计1对PEDV N基因的特异性引物，建立Eva Green染料的实时荧光定量RT-PCR的检测方法，并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测。结果显示，所建立的实时荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系，线性相关系数R2=0.999；不与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）发生交叉反应，具有较强的特异性；灵敏度比常规RT-PCR方法高100倍；重复性试验的变异系数均小于5%，重复性良好。对43份临床样品进行检测，结果比普通PCR多检出2份阳性。结果表明，本研究建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法在特异性、灵敏度和重复性方面都很好，可用于临床PEDV检测。

8 双抗体夹心ELISA检测方法

王晨燕等[15]采用特异性好的鼠源抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）单克隆抗体为捕获抗体，兔源多克隆抗体为检测抗体，建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示，该方法的最佳反应条件为：抗PEDV单克隆抗体 E1包被质量浓度 4.40μg·ml-1，37℃包被 2小时，采用5%BSA封闭液封闭1小时，兔抗PEDV抗体工作质量浓度为5.91μg·ml-1，酶标二抗稀释度为1∶2000，以OD(450nm)≥0.381作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。敏感度可达30μg·ml-1；重复性变异系数小于10%。采用该方法和RT-PCR方法同时检测临床样品42份，阳性样品符合率为92.30%，表明建立的PEDV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高和方便快捷等优点，可用于PEDV快速检测。