miRNA- 21与器官损伤和纤维化的关系及研究进展

王伟，方申存，张海涛，王彩英，张映铭

(1.东南大学医学院附属南京市胸科医院 内镜中心, 江苏 南京 210009； 2. 东南大学医学院附属

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类长度20～25个核苷酸的高度保守、内源性非编码小RNA，广泛存在于植物、线虫及人类的细胞，通过转录后调控靶基因的表达，在生长发育、细胞增殖分化、肿瘤发生发展等一系列病理生理过程中发挥重要作用。近年来，针对miRNAs的各类研究在表观修饰相关研究中仍占相当部分。众多已知miRNAs中，miRNA- 21持续受到关注。人类miRNA- 21位于TMEM49基因17q23的内含子脆性区域，前体- miRNA- 21以自身引导区进行独立转录后成为成熟miRNA- 21[1]。已有多项研究表明，miRNA- 21在肾癌[2]、结肠癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]、口腔癌[6]、胰腺癌[7]等多种类型恶性肿瘤中表达水平升高，并负性调控各抑癌基因，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，故又被称为癌基因微小RNA(oncomiRNA)。后于结肠癌组织中发现过表达的miRNA- 21并非来源于癌实质细胞，而是源于环绕癌细胞周围的人成纤维细胞[3]，其机制是miRNA- 21参与调控了上皮间质转化(epithelial mesenchymal transtion,EMT)。近来更多研究发现，miRNA- 21参与了生物体各重要脏器损伤和纤维化的发生发展，作者拟对这方面内容以及miRNA- 21检测技术作一综述，旨在为器官纤维化的临床诊治策略提供新的思路。

1 miRNA- 21与脏器损伤和纤维化

1.1 miRNA- 21与心脏损伤和纤维化

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是导致心肌细胞损伤凋亡和临床心力衰竭的重要病因之一。近年有关研究证实miRNA- 21对I/R有重要影响。Ning等[8]发现，成年鼠I/R继发心肌纤维化模型中miRNA- 21表达显著升高，且不受血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)这一心肌细胞纤维化重要调控因子的影响，提示miRNA- 21通过非Ang依赖方式调控了心肌细胞纤维化。随着近来缺血后适应(ischemic postconditioning，IPost)概念的提出，Tu等[9]试验发现IPost小鼠模型中miRNA- 21表达上升，IPost可缩小I/R所导致的左心室梗死范围，防止心肌细胞凋亡，改善心功能，敲减miRNA- 21后上述效应明显削弱。研究发现miRNA- 21通过下游PTEN/Akt信号通路活化来减少心肌细胞凋亡，该效应可被PI3K抑制剂LY294002所抑制。此项实验表明miRNA- 21参与IPost并体现出对抗I/R心肌损伤导致心功能障碍的作用，有望作为缺血性心肌保护的备选治疗靶标。更有研究发现，miRNA- 21的表达还受到抗心绞痛药物曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)的调节。TMZ药理作用是通过保护心肌细胞在缺氧缺血状态下的能量代谢，阻止胞内ATP下降，维持内环境稳定，从而改善左室功能。Liu等[10]体外试验发现经TMZ处理的右室心肌细胞(RV myocardial cells, RVMCs)miRNA- 21呈高表达，细胞凋亡数下降；如以miRNA- 21特异性抑制剂转染RVMCs细胞株，则会削弱TMZ的保护作用；该试验提示miRNA- 21对TMZ可能具有负向反馈作用，或能作为缺血性右室心肌功能衰竭的评估标记。

miRNA- 21与心脏纤维化的关系已由小鼠模型试验得到证实，研究发现miRNA- 21在正常心肌中呈现弱表达，但在心衰状态下心肌细胞中呈高表达。进一步研究发现miRNA- 21集中富集表达于心肌成纤维细胞[11- 12]；miRNA- 21的过表达促使ERK- MAPK活化，表明miRNA- 21也是ERK- MARK的重要调节信号，这对于心肌成纤维细胞的生存和活化具有关键作用[13]。也有试验发现，通过主动脉横向狭窄(transverse aortic constriction,TAC)达到左室压力超负荷状态制作小鼠心肌纤维化模型后，对小鼠注射miRNA- 21特异性反义寡核苷酸调节SPRY1表达和MAP激酶活化，可改善心肌纤维化[12]。

在临床诊断方面，Nishi等[14]检测了29例心血管手术后并发房颤及心肌纤维化患者的心房组织标本，发现miRNA- 21表达明显升高，且上升程度与心房心肌细胞纤维化程度具有相关性(r=0.508，P<0.05)，故认为miRNA- 21可能作为心血管术后并发房颤和心肌纤维化的临床生物标记。杨寿娟等[15]发现冠心病患者外周血中miRNA- 21的表达水平与冠脉狭窄程度有正相关性，而急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者血miRNA- 21高表达的检测敏感度为68.85%，与CK、CK- MB、cTnI诊断AMI具有相似敏感度，故认为miRNA- 21有望作为AMI新的诊断指标。

在疾病治疗方面，Zhou等[16]以免疫磁珠分离制备纯小鼠Sca- 1+干细胞，分为空白对照、上调miRNA- 21、下调miRNA- 21和阴性对照4组，进行流式细胞仪、qRT- PCR、Transwell实验和MTT法检测，进行ATA- 4、MEF2C、TnI和βMHC分化相关基因的表达分析。结果表明：Sca- 1+干细胞分离制备成功(占总细胞数87.4%)，上调RNA- 21组的miRNA- 21表达水平明显升高(均P<0.05)，且能调控表达增殖、迁徙和分化的下游基因如GATA- 4、MEF2c、β- MHC；直接上调MIRNA- 21可以促进Sca- 1+干细胞增殖和迁移，帮助提高干细胞修复受损心肌的能力，该结果提示miRNA- 21有可能作为直接修复心肌细胞损伤和功能恢复的治疗策略之一。

1.2 miRNA- 21与肾脏损伤和纤维化

肾脏纤维化是由各种急慢性肾病或体内外致病因素刺激，导致肾固有细胞受损，后期大量胶原沉积造成肾实质硬化、瘢痕形成，肾脏完全丧失功能的病理状态，临床尚缺乏特效治疗。近来不少文献报道发现miRNA- 21参与调控肾纤维化的发生发展。Bao等[17]发现IgA肾病患者的肾小球足细胞和小管间质细胞中miRNA- 21表达明显升高，PTEN表达下降，Akt磷酸化水平增高，出现纤维化病理改变，特异性抑制miRNA- 21则上述效应缓解。Lu等[18]制作小鼠糖尿病模型，结果显示高葡萄糖培养状态下的鼠肾小球系膜细胞miRNA- 21表达升高，随之Ⅰ型胶原发生沉着，肾间质出现明显纤维化；特异性抑制miRNA- 21后，下游PTEN、Akt、mTOR信号表达受抑制，上述效应明显减轻。该实验认为miRNA- 21通过PTEN/Akt/mTOR轴，促进DN肾小球系膜细胞增殖并继发纤维化，故考虑miRNA- 21可作为反映病情严重程度的一个有效标记物。Zhou等[19]观察单侧输尿管梗阻的小鼠模型发现，肾后梗阻病变早期肾小管细胞的表型转换和胞外基质的沉积仅呈局部、零散样分布，但很快纤维化病变即扩大加剧，这一改变单以肾后梗阻、肾小管压力高并不能解释。进一步探究发现已损伤的肾小管细胞可自身分泌miRNA- 21，通过微囊泡形式传送至其它小管细胞，这提示肾小管上皮细胞miRNA- 21的微囊泡传递可能是参与调控肾后性纤维化的一种新方式。miRNA- 21不仅在肾性、肾后性继发纤维化中发挥影响，在肾缺血肾前性急性肾损伤中也呈现高表达。马龙等[20]对小鼠肾I/R模型进行miRNA筛选和验证，发现miRNA- 21在损伤20～30 min直至再灌注24 h后均维持高水平表达，与尿素氮(BUN)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase- associated lipocalin，NGAL)的变化趋势一致，提示miRNA- 21可能作为肾I/R及早期纤维化的重要病情标志。钟瑜等[21]体外培养肾小管上皮细胞(NRK- 52E)，采用TGF- β1诱导制作细胞纤维化模型，以骨形态发生蛋白- 7(bone morphogenetic protein- 7，BMP- 7)处理细胞，检测纤维连接蛋白(fibronectin1，FN1)和miRNA- 21的表达。结果表明miRNA- 21和TGF- β1的表达与肾小管上皮细胞间质转化程度呈正相关，该过程中BMP- 7和Smad1的表达上升，Smad6表达下降，提示miRNA- 21和BMP- 7上调促进了肾小管上皮细胞EMT导致纤维化。Yu等[22]研究发现，体外TGF- β1可以诱导纤连蛋白(FN)分泌和NRK- 52E细胞株的凋亡，随之miRNA- 21出现高表达并能改善FN分泌，对抗NRK- 52E细胞凋亡，敲减miRNA- 21后则失去此作用，此结果提示TGF- β1是miRNA- 21表达升高和FN分泌的强诱导剂，miRNA- 21也可反向作用于TGF- β1引起的细胞凋亡和FN分泌，故是调控肾纤维化发生发展的重要因素。

1.3 miRNA- 21与肺脏损伤和纤维化

肺纤维化是各种致病因素导致肺功能严重损害的常见疾病[23],业已发现下列miRNAs可能与肺纤维化相关，其中Let- 7d、miR- 200、miR- 15、miR- 29、miR- 146、miR- 154、miR- 23a、miR- 26a/b等在肺纤维化进程中表达下调；而miRNA- 21、miR- 155等是少数表达上调的miRNAs[24- 25]。与其它肺纤维化相关的miRNAs相比，miRNA- 21具有如下特点：(1)在肺纤维化动物模型及纤维化组织中均出现表达上调[26- 28]；(2)肺成纤维细胞内TGFβ1能以剂量、时间依赖的方式上调miRNA- 21；后者过表达又可反馈性增强肺纤维母细胞内TGF- β1的促纤维化作用，与TGF- β1形成前馈环路导致肺纤维化效应的放大，促进EMT，细胞外基质不断沉积，最终引起肺纤维化[1,29- 31]，故miRNA- 21的表达水平变化可能反映肺纤维化发生和发展的动态进程；(3)Li等[32]采用qRT- PCT法检测65例特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary interstitial fibrosis，IPF)患者血清miRNA- 21，结果提示IPF患者血清miRNA- 21明显高于健康对照组，且与用力肺活量(forced vital capacity，FVC)和影像改变具有相关性，而同在IPF动物模型中上调的miRNA- 155却未见类似临床上改变，提示miRNA- 21在人肺纤维化进程中扮演重要角色，有望作为人肺纤维化的临床评估标记。Pandit等[33]发现miRNA- 21、miRNA- 155在IPF患者病变组织中均上调，动物实验提示特异性抑制miRNA- 21可减轻小鼠肺纤维化，抑制miRNA- 155和miRNA- 29表达却仅能在体外发挥类似作用，表明miRNA- 21更适宜作为评估IPF病情严重程度和预后的一种稳定可测生物标记。

1.4 miRNA- 21与肝脏损伤和纤维化

肝纤维化是对各种因素引起慢性肝脏损伤的一种代偿性反应，轻度者可逆转，如刺激因素持续则易继发肝硬化。Zhao等[34]检测发现肝硬化患者血清和病变肝组织的miRNA- 21表达水平显著升高，与EMT和纤维化程度相关；此时小鼠肝硬化模型中的肝星状细胞SPRY2和HNF4α表达下调，该效应受miRNA- 21负向调控，故miRNA- 21也可作为肝纤维化病情标记和干预治疗的潜在靶标。血吸虫感染是导致肝纤维化的重要病因之一，He等[35]通过用高嗜肝腺病毒血清型8(recombinant AAV8，rAAV8)处理血吸虫小鼠肝纤维化模型，发现IL- 13和TGF- β1可诱导miRNA- 21表达上调，促进肝星状细胞活化，进一步导致肝纤维化；如持续、有效地抑制miRNA- 21的过表达，则可逆转以Smad7蛋白表达增强为特征的肝纤维化。

1.5 miRNA- 21与其它器官组织纤维化

miRNA- 21除参与调控上述重要脏器损伤和纤维化的发生发展外，Tong等[36]研究发现miR- 21调控甲状腺相关眼病(thyroid- associated ophthalmopathy，TAO)继发后期纤维化的机制。研究所用眼眶成纤维细胞来源于26例TAO患者和10例志愿者捐赠培养而成，试验观察细胞增殖、凋亡和分化，检测分析miRNA- 21、TGF- β1的表达以及由TGF- β1诱导而产生的胶原含量。结果表明，TAO组细胞miRNA- 21表达明显高于对照组，miR- 21可促进TAO眼眶成纤维细胞的增殖、分化，减少其凋亡。不仅如此，miR- 21的过表达也促进了Ⅰ型胶原mRNA的表达和胶原总量的增加。同时，miRNA- 21通过促进Smad3磷酸化反馈性活化TGF- β1/Smad信号通路，使得TAO眼病的纤维化程度进一步加重。

2 miRNA- 21在临床诊断和治疗中的研究进展

上述表明，miRNA- 21可以作为帮助诊断、评估病情和预后的生物标记物。然而，尽管高通量芯片(包括固相微阵列芯片和luminex- xMAP液态芯片)技术、实时荧光定量PCR和经典Northern印迹技术等已为人周知，但临床纤维化患者体内环境复杂多变，如何快速、高选、超灵敏、稳定地检测出目标miRNA仍有待技术手段层面的进一步研究。近年来纳米技术迅速发展，在miRNA- 21的检测方面更趋深入。Kor等[37]采用高特异性结构响应的双功能硫醇和生物素设计制作与纳米金共轭的寡核苷酸探针，测试模拟生物体内源的miRNAs-miRNA mimics，不仅提高miRNA- 21的检测灵敏度，也可增强内源性miRNA的功能。Zhu等[38]报道了一种新颖的两步法构建金纳米棒的官能化的聚二乙炔(PDA)微管进行miRNA- 21的检测。该方法利用波导性质、调整激发和耦合位置减少生物样品的自体荧光，经位移反应、冷凝集富集法等选出高同源性miRNA- 21 PDA微管系统，检测精度最低为0.01 nm，可直接应用于人体血清中特异性miRNA的检出，安全有效、携带方便。Miao等[39]则针对miRNA- 21采用氧化还原剂和铱合成催化一种DNA复合物，以亚甲蓝标记后制成探针修饰到纳米金粒子表面，通过电化学信号变化和生物分析传感器可超灵敏地测出miRNA- 21(FM1.6)，该方法也适宜于人血清样品。Fang等[40]采用一种锌指蛋白(jasmonate ZIM- domain ZNF346, JAZ ZNF346)选择性结合的DNA捕获探针，能将miRNA- 21与DNA- RNA形成“三明治”形式结合，达到超灵敏度和高特异性的检测效果，该方法对miRNA- 21的10倍稀释的血清检测范围是2～30 FM，易于扩增，是检测体液miRNA- 21的一种可行方式。Rafiee等[41]尝试采用单链DNA成功固定探针和杂交的靶miRNA序列，通过电化学阻抗(EIS)谱、循环伏安法(CV)、微分脉冲伏安法(DPV)技术记录氧化亚甲蓝的时段峰值电流增加幅度。据此测出的miRNA- 21相对低限是84.3 FM。miRNA- 21主要通过与mRNAs直接作用抑制翻译或去稳定化，导致miRNAs失调，引发多种疾病。目前使用较广的经化学修饰的反义寡核苷酸链(antisense oligonucleotides, ASO)虽可直接抑制miRNA功能，但其细胞膜穿透力差，且会在内涵体中聚集，脱靶率高，因此发展化学小分子抑制剂对于调控miRNA的功能有重要意义。Yan等[42]报道了他们所设计的双功能小分子抑制剂，这里所指的双功能之一是可以高特异性与pre- miRNA结合，另一则是Dicer酶的小分子抑制剂，当与Dicer达到一定距离时则可有效抑制酶活性，阻止miRNA的生物合成。该研究选择miRNA- 21为研究对象，利用kanamycin的衍生物KOF为标准pre- miRNA- 21的结合小分子，通过荧光偏振法筛选到能和pre- miRNA- 21结合的小分子NF，同时选择了一个Dicer的小分子抑制剂，将两部分结合并合成双功能miRNA- 21的小分子抑制剂，经过在HEK293T细胞中进行实验，发现可有效抑制miRNA- 21的产生。

3 总结和展望

上述研究表明，miRNA- 21在脏器损伤和纤维化发生发展中的作用机制大致如下：各种损伤因素包括TGF- β等诱导—miRNA- 21表达上调—下游以PTEN为代表的蛋白和信号分子活化—调节成纤维细胞或其它效应细胞的凋亡、增殖、活化、分化、迁移等表型改变—产生EMT/EndMT，基质和胶原增多沉积等各种前纤维化病理改变，最终导致脏器纤维化。在此过程中，miRNA- 21和部分下游因子还可反馈调控TGF- β等诱导物，形成复杂的分子间“对话”(crosstalk)网络，这些表明miRNA- 21对脏器损伤和纤维化具有重要调控作用。近年来由于检测和干预技术方法的发展，miRNA- 21不仅能够用于临床诊断、评估病情，也有望进一步临床转化，成为纤维化疾病未来的治疗靶标。

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