固相微萃取结合气-质联用确定北京干黄酱中关键香气成分

赵星贺，黄佳，刘玉平*

1(清华大学附属中学朝阳学校，北京，100027) 2(北京工商大学 食品学院，北京，100048)

香气是食品与调味品的重要感官指标，目前关于北京干黄酱的香气研究的文献报道较少。石华治等采用同时蒸馏萃取法 (simultaneous distillation and extraction，SDE)提取了天源酱园中挥发性成分，经过气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析，共鉴定出33种成分[1]；苗志伟等采用相同的方法提取与分析了5种干黄酱中的挥发性成分，鉴定出69种成分[3]；刘永国等采用水蒸气蒸馏(steam distillation，SD)提取结合气-质联机分析了干黄酱中挥发性成分，从中共鉴定出38种成分[4]。采用SDE与SD提取挥发性成分时，样品与水混合加热，会生成某些新成分。由于固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)具有样品用量少、操作简便、使用成本低、快速、不用溶剂等优点[5]，近年来在提取酱类调味品中的挥发性成分中得到普遍使用[6-7]。目前关于干黄酱中香气成分的报道主要是关于其中所含的挥发性成分，这些成分是否具有香气活性，是否是干黄酱的关键香气成分尚未进行确定。本文采用固相微萃取法提取北京产干黄酱中的挥发性成分，利用气相色谱-质谱-嗅闻联用仪(GC-MS-O)对其中的挥发性成分及香气活性物质进行鉴定，利用香气活性值确定其中的关键香成分，以期为生产企业改进生产工艺提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

仙源牌干黄酱(原料：非转基因大豆、水、小麦粉、食用盐、食品添加剂-山梨酸钾)，净含量250 g，塑料袋包装，北京通州酿造厂生产，生产日期2017年7月13日；C6～C30正构烷烃(色谱纯)，美国Supelco公司；苯乙醇、麦芽酚、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、2,3-丁二酮、2-乙酰基呋喃、二甲基三硫和2-甲氧基苯酚(均为分析纯)，北京百灵威科技有限公司；丙酸乙酯与辛醛(分析纯)，北京华威锐科化工有限公司；苯乙醛和1-辛烯-3-酮(分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司；2-甲基丙酸乙酯(分析纯)，adamas公司；丁酸乙酯(分析纯)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；茴香脑(分析纯)，上海源叶生物科技有限公司；甲硫醇(质量浓度为2 000 μg/mL的甲苯溶液)，Accu Standard公司。

1.2　仪器与设备

7890B气相色谱-5977A质谱联用仪，美国安捷仑公司，，-sniffer3000嗅觉检测器，德国Gerstel公司；2 cm长50 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS (灰色)萃取纤维、手动固相微萃取手柄，美国Supleco公司；DF-lO1S 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器责任有限公司。

1.3　实验方法

1.3.1固相微萃取法提取干黄酱中的挥发性成分

在40 mL固相微萃取专用瓶中依次加入10 g干黄酱、15 mL饱和食盐水和30 μL(质量浓度为56.872 5 μg/L)的内标2-辛醇，在45 ℃水浴中平衡20 min。将2 cm长的灰色萃取纤维在GC-MS的气相色谱仪进样口中在250 ℃下老化至无杂峰，将萃取纤维插入装有干黄酱的固相微萃取专用瓶中，吸附40 min；拔出萃取纤维，插入气相色谱仪进样口中，在250 ℃下解吸附5 min。

1.3.2GC-MS分析条件

气相色谱条件：使用DB-WAX(30.0 m×250 μm，0.25 μm)极性色谱柱；采用程序升温，起始温度为40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min 的速率升至80 ℃，之后以4 ℃/min 的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持5 min；载气He，载气流量1.0 mL/min。

共和县处于藏区，人们的饮食习惯主要是面食、青稞炒面以及肉类为主，对于蔬菜的需求量不是太大。2017年，共和县蔬菜产量分布如下：

质谱条件：电子电离(EI)源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描模式为Scan，扫描质量范围33～350 u。

嗅觉检测器条件：从色谱柱流出的馏分以1∶1的体积比分别进入嗅觉检测器和质谱检测器，传输线的温度是250 ℃。嗅闻口温度220 ℃。

1.3.3正构烷烃保留时间的确定及保留指数的计算

取0.2 μL C7～C30正构烷烃的正己烷溶液，在1.3.2的GC-MS条件下进行分析，得到C6～C30正构烷烃的保留时间，用于保留指数的计算。保留指数按公式(1)计算：

(1)

式中:tn为具有n个碳原子的正构烷烃的保留时间；t(n+1)为具有(n+1)个碳原子的正构烷烃的保留时间；ti为待测组分的保留时间, 且tn

1.4　定性定量分析

定性分析：挥发性成分的定性采用质谱、保留指数和标准品3种方法。

定量分析：采用2-辛醇为内标，进行半定量，香气活性成分的含量(μg/kg)按公式(2)计算：

(2)

2　结果与分析

2.1　挥发性成分与香气活性物质的鉴定

经过萃取纤维萃取得到的挥发性成分经GC-MS-O分析，得到的总离子流图如图1所示，通过计算保留指数、检索NIST11L谱库、采用标准品对有香气活性的物质进行比对，具体鉴定结果见表1。

图1　通过固相微萃取提取到的北京干黄酱中挥发性成分总离子流图Fig.1　Total ion chromatogram of volatile components inBeijing dry yellow soybean sauce obtained by SPME

从表1可以看出，共鉴定出53种成分，其中醇类7种，酸类6种，酯类9种，醛类10种，酮类8种，吡嗪类5种，含硫化合物4种，酚类2种，其他2种。在这些成分中有44种在质谱检测器上有响应，有20种在嗅觉检测器上能够被嗅闻到；两种检测器都能检测到的有11种。

从目前对酱的风味成分分析的文献报道可以看到，它们基本上都是报道酱中的挥发性成分[1,3,4,6,8-9]，而关于其中的香气活性成分(即通过嗅觉检测器能够嗅闻到的成分)的报道则很少[10-11]。从表1可知，挥发性成分的含量多少不是判别该成分是否是重要香气成分的决定因素，鉴定出来的多数挥发性成分不是香气活性物质；鉴定出来的香气活性物质中有一半以上的成分在质谱检测器上没有响应，因此只根据GC-MS的结果判断某一成分是否对香气有贡献是很片面的。如何对这些具有香气活性而在质谱检测器上没有响应(在总离子流图上没有色谱峰)的成分进行定量，需要进行深入研究。

嗅闻干黄酱样品时，能够嗅闻到酱香、焦糖香、甜香、酸香、烟熏香、腌咸菜等，这些香气属性与鉴定出来的香气活性物质是相关的，如3-甲硫基丙醛赋予了干黄酱酱香，它在水中的香气阈值很低(0.43 μg/kg[12])，极易被嗅觉检测到；麦芽酚与2-甲基丁醛赋予了干黄酱焦糖香;酸香是由乙酸与3-甲基丁酸赋予的;2-甲氧基苯酚赋予了干黄酱烟熏香;二甲基三硫赋予了腌咸菜的气息。在样品中鉴定出5种吡嗪类化合物，都没有嗅闻到它们的香气。由于在分析过程中为了鉴定每种成分采用气相色谱将它们分开，可能由于每种成分的阈值较高且含量低，不能被嗅觉检测到；而在实际样品中它们混合在一起以后某种香气属性的阈值可能达到嗅觉的检测范围，对干黄酱的香气具有一定贡献。对于表1中鉴定出来的一类物质都没有被嗅闻到它们的香气的，在以后的研究中将采用添加实验来进一步确定它们对干黄酱的香气贡献大小。

续表1

类型保留时间/min化合物名称CAS号匹配度保留指数计算值文献值定性方法含量μg/kg嗅闻到的香气特征吡嗪类10.76甲基吡嗪109-08-09012491256MS,RI20.22-12.172,5-二甲基吡嗪123-32-09113081314MS,RI10.90-12.322,6-二甲基吡嗪108-50-98713151320MS,RI42.82-13.732-乙基-6-甲基吡嗪13925-03-68613721382MS,RI4.52-14.20三甲基吡嗪14667-55-19113911395MS,RI18.21-5种96.67含硫类2.56甲硫醇74-93-1679675RI,S,O臭萝卜2.81二甲基硫醚75-18-394736746MS,RI44.82-6.75二甲基二硫624-92-09710571071MS,RI,S45.61-13.56二甲基三硫3658-80-89013651378MS,RI,S,O7.84腌咸菜4种98.27酚类23.172-甲氧基苯酚90-05-19618301823MS,RI,S,O91.84烟熏香25.56苯酚108-95-29419711973MS,RI12.27-2种104.11其他类9.31D-柠檬烯5989-27-5991186MS11.11-22.72茴香脑104-46-19318041815MS,RI4.87茴香2种15.98

注：表中MS表示质谱定性，RI表示保留指数定性(保留指数的文献值来自http://webbook.nist.gov/chemistry/cas-ser.html)，S表示采用标准品进行定性，O表示通过比对与标准品的香气定性；“-”表示没有嗅闻到香气。

鉴定出来的这些挥发性成分主要有以下5种生成途径：一是通过微生物新陈代谢所产生。在制作干黄酱时，微生物代谢会产生一些挥发性成分(或者微生物释放出一些能够分解原料产生挥发性成分的酶)，如乳酸菌会代谢出乙酸[13]；二是通过不饱和脂肪酸的降解产生。制作干黄酱的原料大豆中含有油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸[14]，这些不饱和脂肪酸可以发生氧化降解生成己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-酮等[15]；三是氨基酸的降解。制作干黄酱的原料大豆和小麦粉中都含有氨基酸，氨基酸发生降解产生了挥发性成分，如3-甲基丁醛可由亮氨酸降解产生[11]，3-甲硫基丙醛和甲硫醇可由蛋氨酸降解产生[16]；四是通过美拉德反应产生。鉴定出来的吡嗪、吡咯、呋喃类化合物都可以通过美拉德反应产生[17-18]；五是通过原料挥发性成分之间的反应产生。有的微生物代谢会产生脂肪酶，脂肪酶催化醇与酸的反应，产生酯类挥发性成分；六是原料带入。生产酱时会使用少量的辛香料，由此带入一些挥发性成分，如鉴定出来的茴香脑和柠檬烯可能就是由此。

目前文献报道的提取北京干黄酱中的挥发性成分所用的方法是SDE[1,3]与SD[4]，从SDE提取物中鉴定出来的挥发性成分中酯类最多(有22种，只有乙酸乙酯、十六酸甲酯和十六酸乙酯3种在SPME提取物中鉴定出来)，而未鉴定出脂肪醇类物质[3]，在鉴定出的酯类中有一半以上为高级脂肪酸的低级醇酯，这与采用SDE提取挥发性成分时加热有关；加热会有利于一些沸点相对较高的成分的提取，同时也会使一些成分变化(如醇与酸反应生成酯，醇氧化生成醛或酸)；在SPME提取物中鉴定出来的酯类主要是分子量较低的脂肪酸的乙酯。从SD提取物中鉴定出来的38种挥发性成分中醛类和酸各有10种[4]，在这20种成分中只有8种在SPME提取物也鉴定出来。在SPME的提取物中鉴定出来的甲硫醇、二甲基硫醚和二甲基三硫在SDE和SD中都没有鉴定出来，甲硫醇、二甲基硫醚沸点较低，在SDE与SD提取过程中随着溶剂的去除它们也被去除了；二甲基三硫不稳定，受热容易脱硫生成二甲基二硫。

2.2　关键香气成分的确定

通过采用GC-MS-O可以从众多挥发性成分中筛选出香气活性成分，为了确定关键香气成分，需要计算香气活性物质的香气活性值(odor activity value, OAV)。香气阈值是指香气活性物质能够被人的嗅觉所能嗅闻到的最低浓度；香气活性值是指香气活性物质的浓度与其香气阈值的比值，只有那些OAV大于1的香气活性物质才是关键香气成分[19]。为了确定干黄酱中的关键香成分，计算了香气活性物质的OAV，所得结果如表2所示。

表2　北京干黄酱中香气活性物质的香气活性值Table 2　Odor activity values of aroma-active compoundsin Beijing dry yellow soybean sauce

从表2所得结果可知，鉴定出来的香气活性物质中多数为关键香气成分，它们对干黄酱的特征香气起到了重要作用，其中3-甲基丁醛具有最高的OAV(为2 642.4)，其次为二甲基三硫与2-甲氧基苯酚，它们的OAV分别为791.9和109.3。

2.3　非香气活性成分的香气活性值的计算

为了确定干黄酱中鉴定出来的非香气活性物质中是否有OAV大于1的物质，计算了没有嗅闻到香气的挥发性成分的OAV，所得结果见表3。

从表3可知，33种未被嗅闻到香气的挥发性成分中，有20种成分的阈值有文献报道，经过计算只有3种成分的OAV大于1，这3种成分分别是二甲基硫醚、二甲基二硫醚和己醛；它们的OAV大于1，而没有被嗅闻到香气的主要原因有以下3点，一是文献报道的阈值测定方法不同，所得结果有一定差别，如在文献[22]中报道的己醛的阈值为4.1～22.8 μg/kg，而文献[12]中报道的是2.4 μg/kg；二是挥发性香成分的阈值大小与其所在基质关系很大，为了便于比较在此选用的都是在水中的阈值，该阈值小于在实际食品基质中的阈值；三是挥发性成分通过气相色谱进行分离时，有时会出现馏分共流出现象，如果共流出的香气成分之间发生相互抑制[24]，香气强度会减弱，不能被嗅闻到。这3种成分是否是干黄酱的关键香气成分，尚需进一步研究。

表3　北京干黄酱中非香气活性物质的香气活性值Table 3　Odor activity values of non-aroma-activecompounds in Beijing dry yellow soybean sauce

注：“-”表中没有查找到该成分的阈值。

3　结论

采用固相微萃取结合GC-MS-O，对北京干黄酱中的挥发性成分进行提取与分析，共鉴定出53种成分，其中醇类7种，酸类6种，酯类9种，醛类10种，酮类8种，吡嗪类5种，含硫化合物4种，酚类2种，其他2种。在鉴定出来的53种成分中具有香气活性的物质有20种。经过计算，香气活性物质的活性值确定出3-甲基丁醛、二甲基三硫、2-甲氧基苯酚、苯乙醛、丁酸乙酯、壬醛和3-甲基丁酸为干黄酱的关键香气成分。

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