有机硒营养液对蓝莓营养品质和抗氧化作用的影响

李春霞，刘伟，陈凌云，姜文仪，蒋光月，黄蓓*

1(安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥，230601) 2(安徽省农科院，安徽 合肥，230031)

蓝莓又名笃斯、蓝浆果，属杜鹃花科，越橘属植物，原产和主产于美国又被称为美国蓝莓。我国蓝莓主要以北高丛、半高丛、矮丛以及兔眼蓝莓为主，如布里吉塔、芭尔德温等，种植面积约47万亩，蓝莓产量仅为3.133万h2。蓝莓果实中除了常规的酸和VC外，富含VE、VA、VB、SOD、蛋白质、花青苷、食用纤维以及丰富的K、Fe、Zn、Ca等矿质元素,且低糖、低脂肪，因此被国际粮农组织列为人类5大健康食品之一，被誉为“浆果之王”[1-2]。

硒元素是在1918年由瑞典化学家JBERZELIUZ发现，并在1973年被世界卫生组织定为生物生命活动必需的微量元素。研究显示硒作为含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性中心，调节着生物体抗氧化防御体系的主要组成部分[14]。研究还发现，硒在植物体内还有拮抗重金属，调节包括VC、VE在内的非酶氧化系统，平衡功能元素在体内代谢的功能。农业应用中多以亚硒酸钠作为农产品中外加源硒的硒源，但亚硒酸钠存在使用安全性等问题，本实验所用的是低毒有机硒营养液。张敏等[15]在含硒盐培养基中加入ZM菌发酵，制得生物硒，且已证明作为主药治疗癌症时无不良反应。刘军等[16]研究说明生物硒比无机硒更能安全有效地促进韭菜叶片对N、P、K、Mg、Ca、Zn等营养元素的吸收。与亚硒酸钠相比，EM(effective micro-organism)菌发酵制得的生物硒明显提高大米中硒的含量，而且叶面喷施更安全有效[17]。生物硒制备方法是我国自主研发的微生物生产菌硒的工艺。生物硒肥是一类成本低、效果高、毒性小的新型富硒肥料[18]。给蓝莓施亚硒酸钠后，浆果中总硒、有机硒、可溶性糖的含量及SOD活性明显提高，促进矿质元素吸收，而且叶面喷施的效果优于土壤基施[19]。目前关于喷施生物硒肥后蓝莓营养品质的变化及对小鼠抗氧化功能影响的研究未见报道。

本实验利用亚硒酸钠与菌种发酵所制备的有机硒营养液叶面喷施蓝莓植株，检测其营养指标，通过体外培养细胞自由基清除实验及小鼠体内抗氧化酶活性实验，评估硒对蓝莓营养品质改善以及施有机硒蓝莓对抗氧化能力的影响效果，为优质抗氧化活性的蓝莓产品的开发应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　材料、动物与试剂

蓝莓(布里吉塔)植株，由安徽芜湖宏源农业有限公司提供。

亚硒酸钠水溶液及发酵菌种(酵母菌和枯草杆菌等多种益生菌)，由安徽省农业科学院土壤肥料研究所提供。

SPF级昆明小鼠40只，体重(20±2)g，雄性，购自安徽医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。

HepG2细胞，购自上海中科院细胞库。

GIBCO血清，Thermo Fisher；DMEM培养基，HyClone公司产品；活性氧检测试剂盒，碧云天生物技术公司；H2O2(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；SOD试剂盒、MDA试剂盒、GSH-Px试剂盒、VC试剂盒、VE试剂盒，南京建成生物研究所；HNO3(分析纯)，上海振兴化工二厂；HClO4(分析纯)，上海金鹿化工有限公司；NaBH4(分析纯)，湖北赛创科技有限责任公司；HCl、乙酸钠、KCl及甲醇等试剂均为国产分析纯。

1.2　仪器与设备

AFS-3100型双道原子荧光光度计，北京海光仪器公司；SameCOM Liss XA量子共振检测仪，同康科技有限公司；UItrospec 3100 pro紫外可见分光光度计，英国柏楉有限公司；Eppendorf centrifuge 5417R离心机，德国Eppendorf公司；Alpha 1-2 LD plus冻干机，德国Chriet公司；激光共聚焦显微镜FV1000-IX81，日本OLYMPUS公司；3308型CO2培养箱，美国Thermo Fisher Forma公司。

1.3　实验方法

1.3.1有机硒营养液制备及施肥方法

利用安徽省农业科学院土壤肥料研究所提供的亚硒酸钠水溶液和菌种以及基料，在实验室中把菌种和液体基料混合搅拌均匀后好氧保存1 d，加入无机态亚硒酸钠溶液，每次加入的亚硒酸钠总量2.0 g/100 mL混合液，共加入2次，间隔7 d。期间开口搅拌或摇晃，作用14 d后，红色溶液增稠、稳定即形成试验用有机硒营养液产品。

在试验区内，选择长势大小一致的5年生植株，分为对照组、无机硒组和有机硒组，每组选20株蓝莓，对照为清水，无机硒组为亚硒酸钠水溶液，有机硒组为有机硒营养液，无机硒组和有机硒组总Se含量一致，分别在座果后期、膨大前期、膨大后期叶面喷施，施用量为1次或2次，间隔10到15 d，总硒剂量理论值以2 g/亩(220棵)计算, 喷洒质量浓度为50 mg/L，座果25 d后收集果实，称取重量，计算单颗平均重量，检测硒的含量及有机硒和总硒的比值。

1.3.2硒含量的测定

将采集的新鲜的清水蓝莓(watered blueberry ,WB)、无机硒蓝莓(selenium blueberry ,SB)及有机硒蓝莓(organic selenium blueberry ,OSB)制成匀浆，冷冻干燥，分别称取1.0 g干粉于50 mL三角瓶中，加入10 mLV(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1混合酸液，放置12 h，置于电热板上低温加热蒸发至有机物分解或色泽加深，补加1～3 mL消化液继续消化，如此反复至消化液澄清，有HClO4白烟冒出，继续加热至溶液1～3 mL，用60%浓HCl定容在25 mL容量瓶中，然后加0.5% NaBH4至反应终点，用双道原子荧光光度计测量总硒含量。

将采集的各组新鲜的蓝莓制成匀浆，冷冻干燥，分别称取1.0 g干粉，加10～20 mL的蒸馏水，置于加热板上加热沸腾20～30 min，冷却,4 000 r/min离心10 min，保存上清液，残渣再重复1次操作，合并上清液，加入10 mLV(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1混合酸液，放置12 h，置于电热板上低温加热至有机物分解或色泽加深，补加1～2 mL消化液继续消化，如此反复至消化液澄清，有HClO4白烟冒出，继续加热至溶液1～2 mL，用60%浓HCl定容在25 mL容量瓶中，然后加0.5% NaBH4至反应终点，用双道原子荧光光度计测量无机硒含量，然后总硒含量减去无机硒含量即是有机硒的含量。

1.3.3蓝莓中营养指标的检测

将各组蓝莓新鲜果实打成匀浆，分别用pH计和手持数显糖度计测定pH值和可溶性固形物含量；采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量；参照吴春霞等[20]方法对总黄酮含量进行测定；采用凯氏定氮法测定蛋白质含量[21]；采用蒽酮法测定可溶性糖含量[22]。

1.3.4总SOD活性及VC、VE与花青素含量的检测

准确称取新鲜蓝莓2 g，加入0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液8 mL，冰水浴条件下，机械匀浆，匀浆液在4 ℃条件下，以4 000 r/min离心10 min，收集上清液，依照试剂盒要求测定总SOD的含量。

称取新鲜的蓝莓50 mg，加入450 μL的PBS，冰水浴研磨破碎，4 ℃条件下，以4 000 r/min离心10 min，收集上清液，依照试剂盒要求测定VC的含量。

称取新鲜的蓝莓1 g，加入试剂盒中的试剂四(匀浆介质)9 mL，冰水浴研磨匀浆，4 ℃条件下，以2 500 r/min离心10 min，收集上清液，依照试剂盒要求测定VE的含量。

花青素提取液的制备：参照周方等[23]的方法并改进，分别称取各组新鲜的蓝莓各4 g，分别放入50 mL的离心管中，再各加入40 mL的盐酸-甲醇混合液(含0.1%的HCl)，在80 ℃下振荡提取30 min，收集提取液，在3 000 r/min下离心30 min后收集上清液待测。

花青素含量测定[24]：吸取样液1 mL,加入pH 4.5的乙酸钠缓冲液4 mL，摇匀，测定在波长520 nm和700 nm处的吸光度值；同上，吸取上述样液1 mL，加入pH 1.0的KCl缓冲液4 mL，摇匀，测定波长510 nm和700 nm处的吸光度值。

1.3.5量子共振检测样品的量价值

将采集的各组新鲜的蓝莓制成匀浆，冷冻干燥成干粉，分别称取1.0 g左右的样品干粉直接放在检测盘上，利用量子共振检测仪检测各组蓝莓的磷、钾、氮、钙、维生素等营养价值指标的量价值，以及分析其免疫功能等生理功能指标的量价值。

1.3.6细胞内活性氧检测

取对数生长期的HepG2细胞，用胰蛋白酶消化并用含10%血清的培养基调制成 5×104个/mL，以每皿 1 mL接种至共聚焦小皿中。细胞生长到80%时，弃去旧的培养液；分别加入含SB(27.04 mg/mL)、OSB(27.04 mg/mL)及WB(27.04 mg/mL)的细胞培养基1 mL，孵育3 h后，加入10 mmol/L H2O2溶液25 μL(终浓度为2 mmol/L),阴性对照组(negative control ,NC)加入等量的PBS，孵育1 h，取出旧的细胞液，用 PBS 洗涤细胞2次，加入10 μmol/L的DCFH-DA溶液 1 mL，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min后吸弃，并用无血清细胞培养液洗涤细胞，再加入1 mL的无血清细胞培养液，将小皿置于共聚焦显微镜上，激发波长488 nm，发射波长 525 nm记录胞内荧光强度，使用ImageJ软件分析胞内荧光强度。

1.3.7小鼠模型的建立及检测

将小鼠随机分成4组：阴性对照组(negative control ,NC)，WB组，SB组，OSB组,每组10只。NC组每日灌胃蒸馏水；WB组每日灌胃施清水蓝莓，灌胃剂量是10 g/kg；SB组和OSB组每日分别灌胃施无机硒蓝莓匀浆、施有机硒蓝莓匀浆，灌胃剂量是10 g/kg，连续30 d。实验过程中，小鼠采取自由进食、饮水，隔日换水、换垫料。

血清中GSH-Px、SOD的检测：小鼠断尾取血，血样4 ℃静置2 h后，3 000 r/min，4 ℃离心15 min，获得上层血清，-20 ℃保存待测。

肝脏中MDA的检测：取0.5 g的肝脏组织，取5 mL的生理盐水放入烧杯中研磨，3 000 r/min低温离心10 min，取上清液用MDA的检测试剂盒进行检测。

1.3.8数据统计分析

2　结果与分析

2.1　有机硒营养液对蓝莓中营养价值的影响

试验中没有测定喷施清水和硒以外的同区域蓝莓，不能得知施用硒与否对蓝莓产量的影响，但从表1中蓝莓的单颗平均重量来估算，施用硒后，蓝莓产量均有一定幅度的增加。喷施亚硒酸钠水溶液的蓝莓每颗平均重量增加3.77%(p>0.05)，施用有机硒营养液的蓝莓每颗平均质量增加6.25%(p>0.05)，即有机硒营养液处理组的增产幅度比亚硒酸钠水溶液处理组的增产幅度高，且WB中有机硒与总硒的比值为69.70%，SB中有机硒与总硒的比值为72.83%, OSB中有机硒与总硒的比值为76.36%, SB和OSB中硒含量分别是WB的1.39倍与1.67倍，说明有机硒营养液比亚硒酸钠溶液更容易被蓝莓叶片吸收利用和转运。

由表1可知，施用硒与否，对蓝莓的pH值影响不明显(p>0.05)，与WB相比，SB和OSB中蛋白质含量分别提高了14.55%(p<0.01)和24.84%(p<0.01)，可溶性糖含量分别比WB提高了15.15%(p<0.01)和25.89%(p<0.01)，可溶性固形物含量分别提高了12.06%(p<0.05)和22.10%(p<0.01)。

表1　各组蓝莓果实重量和营养物质比较Table 1　Comparison of weight and nutritional compounds in fruits of different blueberry groups

注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，同列不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)；WB，清水蓝莓；SB，无机硒蓝莓；OSB，有机硒蓝莓。表2同。

为探讨蓝莓喷施富硒营养液后对其抗氧化性的影响，本研究分析比较了各组蓝莓鲜果中的总酚、总黄酮、VC、VE和花青素的含量及总SOD的活性。结果显示：蓝莓施肥后不但提高了硒的含量，也影响着与抗氧化活性有关的成分如总酚、总黄酮、VC、VE、花青素和总SOD等，与WB相比，SB和OSB中VC含量分别提高了17.77%(p<0.01)和30.08%(p<0.01)，VE含量分别比WB提高了18.74%(p>0.05)和31.71%(p>0.05)，花青素含量分别提高了10.30%(p>0.05)和20.00%(p>0.05)，总SOD活性分别提高了3.37%(p>0.05)和10.62%(p<0.01)，总酚含量分别提高了13.62%(p<0.01)和21.42%(p<0.01)，总黄酮含量分别提高了11.71%(p<0.01)和22.42%(p<0.01)，说明蓝莓富硒后能够显著提高蓝莓果中抗氧化成分的含量，且有机硒营养液比亚硒酸钠水溶液作用更明显，如表2所示。

表2　各组蓝莓中抗氧化成分比较Table 2　Comparison of antioxidants of different blueberry groups

2.2　有机硒对蓝莓主要功能元素的影响

与此同时，试验用量子共振技术检测了各组蓝莓的主要功能元素的相对含量。量子共振QRS值越高，说明其含量或功能性越好。与WB进行比较，SB和OSB的磷、氮、钙、锌、硒的量价值都高于WB(表3)，OSB的氮、钙、锌、硒的量价值又高于SB；SB和OSB中维生素的量价值也都高于WB，且OSB高于SB；在功能性指标中，OSB的免疫功能量价值达到+7，而WB和SB分别只有+4和+5。以上结果表明，OSB的营养价值要高于WB和SB，免疫力更强，为增强其抗氧化能力奠定了良好的基础。量子共振技术检测得到的数据是相对值，只能做定性判断的依据。

2.3　有机硒蓝莓对细胞内活性氧自由基的清除效果

表3　各组蓝莓QRS值比较Table 3　Comparison of QRS value between blueberry andfertilizing selenium blueberry

活性氧自由基荧光探针DCFH-DA在细胞内本身无荧光，但它可被胞内的H2O2、HO及过氧化硝基氧化形成DCF，DCF激发后可发出绿色荧光，反映了胞内活性氧自由基水平变化。本实验利用H2O2诱导肝癌细胞HepG2产生较高浓度的自由基，然后分别添加WB、SB、OSB，比较分析其对自由基的清除效果。

图 1(A～E)是各实验组细胞经 DCFH-DA 染色后，共聚焦显微镜拍摄的细胞图像。照片的亮度差异反映了细胞经处理后产生的 DCF 荧光强度变化。图1-F为细胞内DCF荧光强度的定量统计分析结果。结果显示：H2O2作用后胞内 ROS是对照组的180.41%(p<0.01)。WB、SB、OSB作用后胞内ROS分别是正常对照组的161.74% (p<0.01)、144.43% 和130.82% 。相对于模型组(MG)，WB、SB、OSB作用后自由基清除率分别是10.34%(p>0.05)、19.94%(p<0.05)和27.49%(p<0.01)。由上可知，与SB处理组相比，有机硒蓝莓对过氧化氢诱发的活性氧自由基抑制效果更显著。

A-阴性对照组；B-模型组，暴露在过氧化氢下1 h；C-暴露在过氧化氢下1 h前，先用SB预处理3 h；D-暴露在过氧化氯下1 h前，先用WB预处理3 h；E-暴露在过氧化氯下1 h前，先用OSB预处理3 h；F-从A到E的荧光检测DCF的水平图1　有机硒蓝莓对HepG2细胞内活性氧自由基含量的影响Fig.1　Effects of fertilizing selenium blueberry on intracellular ROS levels in HepG2 cells注：+为显著性小于0.01对比对照组(NC);*和**分别为显著性小于0.05和0.01对比模型组(MG);比例尺：80 μm。

2.4　有机硒蓝莓对小鼠抗氧化能力的影响

动物体内抗氧化酶GSH-Px、SOD的活性水平及MDA的含量水平能够反应机体的抗氧化能力。本实验分别用WB、SB及OSB灌胃1个月后检测小鼠体内肝脏中MDA含量及血清中的GSH-Px、SOD的抗氧化酶活性。

由图2-A可知，与NC组相比，OSB组、SB组小鼠肝脏组织中MDA 含量分别降低了51.53%(p<0.01)和29.81% (p<0.01)，而WB组只降低了15.02%(p<0.05)。由图2-B、2-C可知，相对于NC组，WB组小鼠血清中GSH-Px和 SOD活性分别增高了12.48%和10.14%，无显著性差异(p>0.05)；OSB组小鼠血清中GSH-Px和SOD活性显著增高了55.94%(p<0.01)和45.93%(p<0.01)；SB组小鼠血清中GSH-Px和SOD活性明显高于NC组(p<0.05),提高了38.02%和29.62%。

图2　有机硒蓝莓对小鼠体内抗氧化酶活性的影响Fig.2　Effect of organic selenium blueberry on the antioxidant enzyme activity in mice注：*和**分别为显著性小于0.05和0.01对比对照组(NC)。

3　结论

研究显示，硒被吸收后形成的硒蛋白可以提高植物的合成代谢效率，使VC、VE等还原型物质合成量增加，即增强植物的抗氧化系统能力[25-26]。常温下无机硒处理浓度为18.0～24.0 mg/L时可以提高SOD的活性[27]，进而影响作物的产量[28]。杨燕君[29]、宁婵娟[30]等研究结果证明，给甜柿和红富士苹果喷施硒肥，可以增加水果中VC、可溶性糖和可溶性固形物的含量，提高水果的品质。本实验利用有机硒营养液喷施蓝莓植株，检测了施硒蓝莓中蛋白质、可溶性糖、可溶性固形物、总酚、总黄酮、微量元素Se、VC、VE和花青素的含量及总SOD的活性，以及氮、磷、钾、钙、锌、维生素、免疫功能等指标的量价值，与喷清水组蓝莓(WB)比较发现，富集硒的同时，蓝莓中氮、磷、钙、锌的含量也发生了变化，施硒蓝莓组中蛋白质、可溶性糖、可溶性固形物、总酚、总黄酮、VC的含量及SOD的活性显著大于WB，VE和花青素的含量也有所提高，且蓝莓产量均有一定幅度的增加；而喷施有机硒营养液的蓝莓无论产量还是营养价值以及功能元素和免疫能力的量价值都高于喷施亚硒酸钠水溶液的蓝莓。

蓝莓富含多糖、黄铜、总酚、花色苷和维生素等抗氧化物质，具备较强的抗氧化能力。陈健[31]、林清华[32]等研究发现，蓝莓花青素通过降低血浆中ALT、MDA含量提高SOD、GSH-Px含量，可以对CCl4所致的小鼠肝损伤起到保护的作用。BARROS等[33]研究发现，蓝莓中的多酚物质具有抗氧化作用，且对DNA的损伤具有保护作用。本实验发现，相比清水蓝莓和无机硒蓝莓，有机硒蓝莓能显著降低小鼠肝组织中MDA的含量，提高血清中SOD和GSH-Px活性，更能有效的清除肝肿瘤细胞胞内的氧自由基。以上实验证实，有机硒具有较高的生物活性及吸收利用率，喷施有机硒营养液的蓝莓其抗氧化性及功能元素量价值均高于喷施亚硒酸钠水溶液的蓝莓。

总之，硒的加入优化了蓝莓的营养谱，提高了蓝莓抗氧化能力，有机硒蓝莓是具有很大开发前景的一种天然高效抗氧化物。

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