南极磷虾微生物复合发酵制备呈味基料的工艺优化

章雪琴，吉宏武,2,3,4*，张迪，段伟文，刘书成,2,3,4

1(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江，524088) 2(广东省水产品加工重点实验室，广东 湛江，524088) 3(广东省海洋食品工程技术研究中心，广东 湛江，524088)4(广东省普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江，524088)

南极磷虾(Euphausiasuperba)又称南极大磷虾，是一种生活在南极洲水域的海洋浮游甲壳类生物，资源丰富，据统计全球资源总量至少有6.5～10亿吨[1]。此外，南极磷虾的降解产物含有丰富的游离氨基酸、肽类、核苷酸等物质[2]，既具有营养保健功能又是良好的呈味物质。其富含的氨基酸包含人体所需的全部必需氨基酸，有些还具有很好的呈味效果，比如带有甜味的甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸，带有鲜味的天冬氨酸、谷氨酸等，还含有一些既能提供鲜味又可以调节人体生理机能的短肽，既是天然的鲜味成分，又具有良好保健作用的核苷酸、肌苷酸、鸟苷酸等物质[3]。因此南极磷虾是制备功能性天然海鲜调味料的理想原料。

微生物发酵法是一种制备调味料的方法，广泛用于味精、酱油、醋等调味品的制备，在改善香肠、鱼露、泡菜风味等方面也有重要作用。用于食品发酵的微生物种类繁多，多采用混合发酵的方式，可以有效地去腥脱苦，改善风味，缩短发酵时间，弥补单一菌种发酵的缺陷[4-6]。NURMI[7]发现在生产香肠的过程中，使用乳酸杆菌和微球菌混合发酵与单一菌种发酵相比，不仅产酸更快而且明显缩短了发酵时间，提高了风味质量。此后，混合菌种发酵剂的使用得到快速的发展。NATTEEWAN UDOMSIL[8]利用TetragenococcushalophilusMS33和Virgibacillussp. SK37两种菌进行复合发酵，缩短了鱼露的发酵时间，提高了氨基酸含量，减少胺类物质的生成，提高了产品的整体接受性。孟凌玉[9]以木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、枯草杆菌对虾的酶解液进行混合发酵，所得产品发酵程度高，发酵液虾味明显，弥补了单一菌种发酵的不足，但是发酵周期较长，香味不够浓郁。本研究在此基础上引入了植物乳酸杆菌和鲁氏酵母菌，直接盐渍后进行半固体发酵。植物乳酸杆菌是发酵过程中的优势菌，分解糖产生乳酸，可降低发酵产物的pH值，抑制大多数腐败菌及致病菌的生长，而鲁氏酵母是典型的产香型菌株，其产生的乙醇与植物乳酸杆菌产生的乳酸作用生成酯类，可显著提高产品的香气指数[10]，所得产品的风味更好。

本实验采用模糊数学综合评价结合响应面分析的方法，优化南极磷虾复合发酵的最佳工艺参数，开发一种既营养又美味的天然海鲜调味料，促进南极磷虾的进一步利用。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

南极磷虾(Euphausiasuperba)：2017年5月购自中国水产有限公司，-40 ℃冻藏；风味蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司；木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus，菌种编号GIMI.895)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，菌种编号GIMI.191)和鲁氏酵母菌(Saccharomycesrouxii，菌种编号AS2.180))：中国科学院菌种保藏中心；MRS培养基 、营养琼脂(NA)、麦芽汁琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

PHST-3F 型酸度计，上海雷磁仪厂; GL-10LND 型离心机，上海安亭科学仪器厂; LDZX-50KBS 型立式蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；HZQ-X100全温振荡培养箱，苏州市培英实验设备有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1测定方法

氨基酸态氮：采用甲醛滴定法 (GB 5009.235—2016)。

1.2.2工艺流程

南极磷虾→切碎→腌制→打浆→发酵→酶解→灭酶→成品

1.2.3操作要点

南极磷虾实验用量为100 g，解冻后切碎；加7%食盐腌制2 h；加1倍水打浆；发酵完成后按0.1%的比例加入风味蛋白酶，50 ℃酶解3 h，灭酶，取上清液，备用。

1.2.4制备菌液

首先将木糖葡萄球菌、植物乳酸杆菌、鲁氏酵母菌分别接种到营养琼脂、MRS培养基、麦芽汁琼脂培养基中活化2次，然后在液体培养基中扩大培养，木糖葡萄球菌、植物乳酸杆菌菌液在振荡培养箱中以80 r/min、37℃培养24 h，鲁氏酵母菌菌液以100 r/min、28 ℃培养48h。最后4 ℃ 3 500 r/min 离心15 min 收集菌体，重悬在 0.85 %无菌生理盐水中，采用平板计数法调整菌悬液菌体浓度为108CFU/mL，备用。

1.2.5实验设计

1.2.5.1单因素实验

以感官评分和氨基态氮含量为指标，首先确定菌种比例，然后初步筛选出影响发酵液品质的发酵温度、发酵时间、接种量3个主要因素的最佳条件。发酵时间：15、18、21、24、27 h, 控制发酵温度30 ℃，接种量4%；发酵温度：22、26、30、34、38 ℃，控制发酵时间21 h，接种量4%；接种量：1%、2%、3%、4%、5%、6%，控制发酵温度30 ℃，发酵时间21 h。

1.2.5.2响应面优化实验

以单因素实验结果为依据(未显示)，以发酵温度(A)、接种量(B)、发酵时间(C)为自变量，综合感官评分为响应值，设计3因素3水平的Box-Behnken试验，试验因素和水平见表1。

表1　Box-Behnken实验因素与水平编码Table 1　Factors and levers of Box-Behnken test

1.2.5.3感官评定方法

参照IRENEUSZ BIALOBRZEWSKI[13]的方法, 由10位感官评定人员对样品进行打分。评定前，使每个评定员对样品的虾味、发酵味、异味、鲜味、口感有明确的了解。然后按感官评分标准表(见表 2)进行评分。

表2　南极磷虾发酵液感官评定标准表Table 2　Standard of sensory evaluation for Antarctic krill fermentation broth

1.2.6建立模糊数学模型

1.2.6.1确立因素集

因素集 U，影响被评判对象感官质量的属性或性能的集合。本实验以气味(u1)、色泽(u2)、形态(u3)、滋味(u4)这4个感官评价指标组成因素集,即U ={u1，u2，u3，u4}。

1.2.6.2确立评语集

评语集 V，反映被评判对象质量等级的集合。将南极磷虾发酵液的感官质量划分为4个等级，即优秀(v1)、良好(v2)、一般(v3)、较差(v4)，V={ v1，v2，v3，v4}，每个等级相对应的分值见表2。

1.2.6.3确定质量因素权重集

权重集 K，影响样品质量的各个因素在被评定因素中所处的地位即权重系数的集合，每个质量因素对应一个权重系数，本实验中 K={气味 k1,色泽 k2,形态 k3,滋味k4}，且 k1+ k2+ k3+ k4=1。

1.2.6.4确立模糊关系综合评判集

对样品的每个质量因素进行评价打分，统计各质量因素在各等级中的票数，将各等级的票数除以总人数得到样品的质量评价模糊关系矩阵A。各样品的模糊数学综合评判集 Y = K × A。

1.3　数据处理与统计

每个试验重复验3次，用 Origin 8.5、Microsoft Excel 2003 和Design Expert8.0.5软件进行数据处理和统计分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2　结果与讨论

2.1　发酵液质量因素的权重分布情况

采用用户调查法[12]，由10 名感官评价员对气味、色泽、形态、滋味4个因素按重要程度打分，总分 10分。统计所有打分，将各因素的得分之和除以总分100分，即得各因素的权重因子。

由表3可知，对发酵液感官品质按重要程度排序，即气味>滋味>色泽>形态，K={气味，色泽，形态，滋味}={0.39，0.185，0.155，0.27}。

表3　评价南极磷虾发酵液风味质量因素的权重分布统计Table 3　Weight distribution and statistics of Antarctickrill fermentation broth’ quality factor

2.2　响应面优化实验结果与分析

2.2.1模糊数学感官评定结果

10位感官评定人员分别对17组样品的气味、色泽、形态、滋味按评价标准进行感官评价。统计每个指标在各等级中的票数，得出南极磷虾复合发酵感官评定结果，见表4。

表4　不同发酵反应条件下感官评定票数分布Table 4　Vote distribution of sensory evaluation of fermentation under different conditions

注: vl: 优秀; v2: 良好; v3: —般; v4: 较差。

2.2.2模糊矩阵的建立及结果

以样品1中的气味指标为例，从表4可知，有0人认为样品的气味处于优秀等级，有3人认为其气味良好，5人认为气味一般，2人认为较差, 样品1的气味因素在各等级的评定人数除以总评定人数10，可得A气味=[0，0.3，0.5，0.2]，同理A色泽=[0.1，0.5，0.3，0.1]。将影响感官评定的4个因素的评价结果转化为模糊关系矩阵,可得：

2.2.3模糊变换及综合评价结果

将权重集K乘以模糊关系矩阵A即可得到样品的综合评价结果Y。同样以1号样品为例。

同理可得另外16组样品的综合评价结果：

Y2=(0.4515，0.389，0.1595，0)；

Y3=(0.119，0.4915，0.3505，0.039)

Y4=(0.2665，0.402，0.2535，0.078)；

Y5=(0.253，0.4035，0.2775，0.066)

Y6=(0.208，0.435，0.213，0.144)；

Y7=(0.4035，0.4135，0.183，0)

Y8=(0.47，0.413，0.117，0) ；

Y9=(0.253，0.529，0.218，0)

Y10=(0.184，0.4845，0.2925，0.039)；

Y11=(0.2875，0.41，0.2755，0.027)

Y12=(0.185，0.5185，0.215，0.0815)；

Y13=(0.3785，0.4775，0.144，0)

Y14=(0.3125，0.3725，0.198，0.117) ；

Y15=(0.262，0.388，0.323，0.027)

Y16=(0.287，0.542，0.171，0)；

Y17=(0.253，0.5，0.247，0)

2.2.4Box-Behnken试验设计结果与分析

为了更好地比较各样品之间的优劣，防止信息缺失，将模糊向量单值化，便于综合比较[13]。将优秀、良好、一般、较差4 个等级按次序赋予 5、4，3、2分，将综合评分结果中各个量分别乘以其相对应的分值，其和作为每个产品的最终感官评定总分T，结果见表5。

2.2.4.1二次回归拟合及方差分析

以感官评定总分为响应值，使用Design Expert 8.0.5软件对以上试验结果进行回归分析，确定南极磷虾发酵液感官评定总分(Y)对发酵温度(A)、发酵剂接种量(B)、发酵时间(C)的二次多元回归方程，去除不显著项，得到回归方程：

Y=4.25+0.17A-0.074B+0.09C-0.16AC-0.34A2-0.25B2-0.01C2

表5　Box-Behnken试验设计结果Table 5　Design and results of Box-Behnken

为了检验该模型的可靠性和各因素对感官评分的影响，对回归模型和回归系数进行方差分析。由表6可知，该模型极显著(p<0.000 1)，失拟项不显著(p=0.925 3>0.05)，说明此模型高度显著可靠，未知因素对试验结果的干扰很小，拟合程度好；相关系数R2=0.974 6，说明模型响应值即感官评分的变化97.46%来自所选因变量，试验误差小，可以很好的反映感官评分与发酵温度、发酵时间和接种量之间的关系[14]。回归方程各项方差分析表明，一次项A、C和交互项AC以及二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著，一次项B对感官评分影响显著，说明各因素之间不是简单的线性关系，而是呈二次关系，响应值的变化比较复杂。由F值可知，各因素对感官评分的影响顺序依次为：A(发酵温度)>B(发酵时间)>C(接种量)。综上所述，使用该模型能够较好对感官评分进行分析和预测，确定最佳发酵工艺参数。

2.2.4.2响应面与等高线结果分析

图1～图3是发酵温度、接种量、发酵时间与相对应的响应值构成的三维空间趋势图，可以直观地反映3因素交互作用对感官评分的影响。从等高线的形状可以看出各因素交互作用的强弱，圆形表示交互作用不显著，椭圆表示交互作用显著；从响应曲面的坡度可以反映因素值的变化对响应值的影响大小，坡度陡峭说明因素值的变化对响应值的影响较大，坡度平缓说明因素值的变化对响应值的影响较小[15]。因此，从图可以看出，AC项的交互作用对感官评分的影响最显著，其次是AB、BC交互项，这与连鑫[10]优化虾酱发酵工艺的结果类似。从图2可知，当发酵时间固定在零水平时，随着温度升高，感官评分先迅速增加，达到一个最大值后缓慢下降，变化趋势较大，说明温度的变化对感官评分的影响很大；当固定温度时，感官评分随着发酵时间变长先增加后下降，时间的变化对感官评分也具有很大影响。等高线图呈现椭圆形，说明发酵时间和发酵温度的交互作用对感官评分具有显著影响。响应曲面有最高点即感官评分有最大值，说明发酵温度和发酵时间过高或过低都不能使感官评分达到最大，只有取其中某个适当值才能使感官评分最大。图1和图3的变化趋势与图2基本类似。

表6　回归模型方差分析Table 6　Variance analysis of fitted model

注：*表示影响显著(p<0.05)，**表示影响极显著(p<0.01)。

图中感官评分随各因素的变化呈现先上升后下降的趋势，可能是因为当发酵温度过高时，超过微生物的最适生长温度，代谢活动降低，对腐败微生物的抑制作用减弱，产生不良气味，致使感官评分下降；而温度过低时，微生物生长受到限制，发酵缓慢，鲜味不足，所以发酵温度在30～32 ℃时发酵液感官评分比较高，此结果与XU YAN-SHUN[18]探究发酵温度对银鲤香肠的品质影响的变化趋势一致。当接种量过高时，随着乳酸菌和酵母菌的增加，会发酵过度，产生酸败味、酒精味，发酵液香气不纯；接种量较低时，发酵味不明显，所以接种量在3%～4%比较合适，FRANCISCO CARRAU[17]等人在探究酿酒酵母接种量对酒香气成分的影响中也证实只有适当的接种量，才能使酒的香味最好；叶劲松[18]在研究发酵时间对发酵猪耳西式火腿品质的影响中也表明发酵时间的选择对产品的质量至关重要，发酵时间太长会使代谢产物积累，产生不良风味；发酵时间太短，微生物和酶没有充分发挥作用，生成的风味物质种类单一，特征风味不够明显，所以发酵时间在22～24 h时，发酵液感官评分比较高。从而也说明这个模型可以很好的反映感官评分和这3个因素的关系。

2.2.4.3验证实验结果

利用Design Expert软件对回归方程进行分析，得到南极磷虾复合发酵的最佳工艺条件为：发酵温度30.71 ℃，发酵时间21.71 h，接种量3.87%，感官评分的预测值为4.28，结合实际，选用发酵温度为31 ℃，发酵时间22 h，接种量4%为最佳条件。为了检测模型预测结果的可靠性，在最优条件下进行3次验证实验，实际测得的感官评分为4.39±0.061，与预测值之间的相对误差为2.57%，误差较小，说明该模型可以准确预测南极磷虾发酵液的感官评分。

图1　发酵温度和接种量对感官评分影响的响应曲面(左)和等高线 (右)Fig.1　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and inoculums on the sensory score

图2　发酵温度和发酵时间对感官评分影响的响应曲面(左)和等高线 (右)Fig.2　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and temperature on the sensory score

图3　发酵时间和接种量对感官评分影响的响应曲面(左)和等高线 (右)Fig.3　The suiface plot(left) and contour plot(right) for effectsof fermentation time and inoculums on the sensory score

3　结论

以南极磷虾为原料，按木糖葡萄球菌∶植物乳酸杆菌∶鲁氏酵母菌=1∶2∶3的比例进行混合发酵，通过模糊感官评价及响应面分析，得到发酵的最佳工艺条件为发酵温度31 ℃，发酵时间21 h, 接种量4%，此条件下，不仅保留了虾的鲜味，同时增加了特殊的发酵香味，得到的产品不仅营养丰富，而且风味饱满、口感协调，促进了南极磷虾的进一步开发利用。

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