壳聚糖酶高产菌株的冷源等离子体诱变及发酵条件的优化

熊妍妍，薛宇航，陈小娥*，冯淑莹，方旭波，袁高峰，余辉

1(浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山，316022)2(杭州万向职业技术学院，浙江 杭州，310023)

壳聚糖酶(chitosanase，EC3.2.1.132.)是一种以内切方式催化水解部分乙酰化壳聚糖中β-1,4氨基葡萄糖苷键的酶，它能将壳聚糖(chitosan)降解为壳寡糖(chitooligosaccharides)。壳寡糖由于其生物相容性好，易于被人体吸收等优势，其商业产品已渗透诸多领域，主要涉及功能性食品、药品、环保、化工等[1]。目前获得壳寡糖的方法有物理法、化学法和生物酶解法三大类。相比而言，物理法、化学法生产壳寡糖会受到分离成本高、污染严重等限制，而生物酶解法生产壳寡糖则有环境相容性好、成本低、重复性好、寡糖产量高等优点[2]，成为了目前壳寡糖生产的理想方法。研究发现，壳聚糖酶不仅可以降解壳聚糖，在农业上也可作为生物防治剂，在生物技术中可用于原生质体分离、细胞化学定位和生产单细胞蛋白等[3]。因此，如何获得优良菌株成为了开发壳聚糖酶微生物发酵法的重要任务[4]。

从自然界筛选出的野生菌株产酶能力一般不高，通过诱变选育是提高产酶水平的有效途径之一[5]。冷源等离体子是一种新型的诱变方法，它在电离过程中会产生活性氧自由基使遗传物质发生改变，如碱基缺失，染色体异位等[6-9]，诱变效率高。此外，冷源等离子体诱变还具有操作简便、节约时间、无毒害性、无严苛条件等优点，被食品加工、制药等行业广泛地应用[10]。

目前关于产壳聚糖酶菌株的诱变选育研究大多采用紫外诱变[11]、化学诱变[12]，采用冷源等离子体诱变的报道较少。本研究以本实验室筛选保藏的菌种为原始菌株，对其进行冷源等离子体诱变，探究诱变的最佳条件，并从中筛选出1株产壳聚糖酶活力最高的菌株，对其发酵条件进行优化，以期为壳聚糖酶的工业化发酵生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1实验菌种

鹿皮曲霉(Aspergilluscervinus)ZJOU-AC1，浙江海洋大学食品与科学工程研究室筛选保藏。

1.1.2培养基

斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，121 ℃灭菌20 min。

计数培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，121 ℃灭菌20 min。

初筛培养基：胶体壳聚糖 5 g/L，酵母膏 1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 5.5～6.0，121 ℃灭菌20min[13]。

复筛培养基：胶体壳聚糖 5 g/L，酵母膏 1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 5.5～6.0，121 ℃灭菌20 min[13]。

种子培养基：胶体壳聚糖 2 g/L，葡萄糖 10 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，自然pH，121 ℃灭菌20 min[14]。

发酵培养基：胶体壳聚糖15 g/L，麸皮 20 g/L，(NH4)2SO44 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.5 g/L，Tween-80 0.6 g/L，121 ℃灭菌20 min[14]。

1.2　仪器与设备

Phenix BK130 /3低温等离子体处理仪，美国凤凰科技公司；UV-5900紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JB-CJ-1FXS 型超净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；HYC-A全温摇床，上海玺袁科学仪器有限公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。

1.3　实验方法

1.3.1冷源等离子体诱变

(1)诱变前预处理：用100 mL无菌水洗下斜面上的孢子，倒入盛有玻璃珠的250 mL锥形瓶中，28 ℃振荡30 min，得到孢子悬液。用血球计数板计数并调整孢子浓度为1×106～5×106个/mL，浓度用CFU法确认[15]。用移液枪移取3 mL孢子悬液，均匀地涂布于无菌平皿中，准备进行低温等离子体诱变。

(2)诱变处理：将装有孢子悬液的平皿放在低温等离子体处理仪的两个电极之间，把电压瞬间调到40 kV，处理的时间分别为0～270 s(处理时间每隔15 s递增)[16]。

(3)诱变后培养：处理后取出平皿，倾斜，用移液枪移取平皿中的孢子悬液，反复轻柔地冲洗平皿上诱变后的孢子。用移液枪移取500 μL孢子悬液，均匀地涂布于初筛培养基上，28 ℃倒置培养5 d，用于单菌落的挑选和致死率的计算。

(4)培养后致死率和突变率的计算：诱变培养后，统计对照组和实验组的单菌落数，计算致死率。

(1)

式中[17]：N为对照组单菌落数,CFU/mL；N’为实验组单菌落数,CFU/mL。

以原始菌株为对照，统计诱变菌株的透明圈大小。用游标卡尺测量透明圈直径与菌株直径，并计算HC值(透明圈直径mm/菌株直径mm)。以HC值为标准，将比值减小或增加10%以上的诱变菌株定义为突变菌株，按公式(1)计算：

(2)

1.3.2突变菌株的筛选

(1)初筛和复筛：在最佳诱变时间段内，选择生长良好的正突变菌株，分别统计HC值并接种到发酵培养基中进行培养，测定壳聚糖酶活力，发酵条件为：发酵时间100 h，发酵温度28 ℃，初始pH值5.5，接种量3%，转速150 r/min[18]。

(2)突变菌株的酶活力及生长特性分析：将筛选出的突变菌株分别接种到发酵培养基，28 ℃，150 r/min发酵培养7 d。每隔24 h取1 mL发酵液测定壳聚糖酶活力，取7 d内的峰值；菌体的生物量测定采用通过比色法测定菌体核酸浓度，并用菌体干重和菌体核酸浓度的线性关系计算得到菌体浓度的方法[18]，每隔24 h测定1次。

(3)遗传稳定性实验：将复筛后酶活力较高的菌株连续传代6代，每代都摇瓶发酵，分别测定各代菌株产的壳聚糖酶活力，验证菌株的遗传稳定性。

(4)突变菌株ZJOU-AC2在发酵培养基上的酶活曲线测定：将保存在斜面上的突变菌株ZJOU-AC2活化后转接到发酵培养基中，28 ℃，150 r/min振荡培养。每隔6 h测1次壳聚糖酶活力。以培养时间为横坐标，酶活力为纵坐标作生长曲线。

1.3.3突变菌株ZJOU-AC2发酵条件优化

将突变菌株ZJOU-AC2接种到种子培养基中，于150 r/min，28 ℃条件下振荡培养3 d。参照1.1.2中的发酵培养基，并设定初始培养条件为：发酵温度为28 ℃，初始pH值5.5，发酵时间为100 h，接种量为3%。对发酵培养的主要影响因素(发酵温度、初始pH值、发酵时间、接种量)进行单因素优化试验，测定各发酵液的壳聚糖酶活力。在250 mL的发酵培养基中，发酵温度设定为26，28，30，32，34 ℃；初始pH值设定为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0；发酵时间分别设定为70，80，90，100，110 h；接种量分别设定为1%，2%，3%，4%，5%。在此基础上，确定各水平的最佳范围，设计正交试验方案。

1.3.4壳聚糖酶活力测定

取1 mL发酵液，4 000 r/min离心10 min，取上清液，稀释成适当倍数的壳聚糖酶液。取1 mL酶液，加入1 mL 1%的胶体壳聚糖，50 ℃下保温15 min，立即加入2 mL DNS溶液，沸水浴10 min，显色反应后放入冷水中冷却。再加入2 mL的蒸馏水，4 000 r/min离心10 min，取上清液在510 nm处测定吸光值。

1个酶活单位(U/mL)：1 mL酶液每分钟产生1 μmoL还原糖所需要的酶量。

1.3.5数据统计与分析

每次实验设置3个平行组，结果取平均值。用绘图软件Origin Pro 8.5绘制折线图和柱状图，采用SPSS 22.0软件进行数据分析。

2　结果与分析

2.1　冷源等离子体诱变结果

2.1.1鹿皮曲霉诱变后致死率分析

冷源等离子体可以使气体产生高度电离的混合物，混合物的多种成分能同时对菌体起作用。据报道，在冷源等离子体中能够发生近500个反应并生成超过75种活性物质[10]。这些活性物质能迅速改变微生物细胞膜的结构与通透性，并引起基因的改变，最终导致微生物产生突变[19]。因此，适宜的条件是控制微生物迅速突变的前提。

图1　不同处理时间下鹿皮曲霉的致死率曲线Fig.1　Variaton of the lethal rate of the Aspergillus cervinusZJOU-AC1 with treatment time

根据诱变理论，80%～90%的致死率有利于正突变菌株的产生[20]。如图1所示，0～150 s内冷源等离子体对鹿皮曲霉的致死率存在一定的剂量关系，致死率曲线呈现经典的马鞍型[21]。在0～45 s之间，鹿皮曲霉的致死率呈现不断上升的趋势，而到45 s时致死率则开始下降，到60 s时致死率下降到最低点，推断是因为细胞内的修复系统开始工作[22]，修复了冷源等离子体诱变对细胞致死的损伤。随着诱变时间的增加，由于细胞内的修复能力不足以修复诱变带来的损伤，则致死率又开始上升。图1结果显示，当处理时间为90 s时，致死率为88.6%，处理105s以后致死率基本稳定在90%以上，处理165 s致死率接近100%。

2.1.2鹿皮曲霉诱变后突变率分析

诱变后平板上共长出183株诱变菌株，对诱变后的鹿皮曲霉进行HC值测定。根据HC值测定结果进行统计，结果表明共有68株突变菌株，其中32株为正突变菌株即HC值增加10%以上。经计算，鹿皮曲霉的突变率为37.16%，正突变率为17.49%。图2为不同诱变时间下正突变率的结果。结果显示，在90 s的时候，正突变率达到峰值4.37%，该结果与蔡聪[20,23]等人的研究相一致。为了获得高产壳聚糖酶和生存能力较强的菌株，本实验选择诱变时间为90 s的菌液平板进行后续实验。

图2　诱变后的正突变率结果Fig.2　The result of positive mutation rates after mutation

2.2　突变菌株的筛选结果

2.2.1初筛和复筛结果

当诱变时间为90 s时，一共筛选出8株正突变菌株。结果由表1可知，突变菌株3#、4#、6#、7#的HC值较大且酶活力也较高。以出发菌株的酶活力作对照为100%，分别表现为菌株3#提高了52.1%，菌株4#提高了49.8%，菌株6#提高了40.4%，菌株7#提高了43.3%。因此，选取这4株突变菌株进行后续实验。

表1　冷源等离子体诱变初筛和复筛试验结果Table 1　The result of preliminary screening and secondary screening test after cold source plasma mutagenesising

2.2.2突变菌株的酶活力及生长特性分析

由图3和图4可知，经过发酵培养后，4株突变菌株的酶活力均高于ZJOU-AC1，这与突变率分析时所测定的结果一致。其中菌株3#和菌株4#的酶活力提高较为明显，菌株3#在培养4 d后的平均酶活力为12.56 U/mL，是ZJOU-AC1的1.52倍，菌株4#在培养4 d后的平均酶活力为12.37 U/mL，是ZJOU-AC1的1.5倍。从生长曲线分析，4株突变菌株的生长趋势基本一致，且生长速度均快于ZJOU-AC1。在第4天，生物量均达到最大值，此时生长最快的菌株3#的生物量是ZJOU-AC1的1.11倍，明显高于ZJOU-AC1。

图3　突变菌株与ZJOU-AC1壳聚糖酶活力的比较Fig.3　Comparision of chitosanase activity betweenmutant strains and ZJOU-AC1

图4　突变菌株与ZJOU-AC1生长速度的比较Fig.4　Comparision of speed between mutant strainsand ZJOU-AC1

2.2.3突变菌株遗传稳定性实验

传代结果如表2所示，菌株3#、4#、6#、7#均具有良好的遗传稳定性，相较而言，菌株3#、6#的稳定性较差。其中，菌株4#在传代过程中最高酶活达到12.45 U/mL，在ZJOU-AC1的基础上提高了50.7%，菌株7#在传代中的最高酶活为11.58 U/mL，酶活性明显低于菌株4#。因此，选取菌株4#作为后续实验的实验菌株，并将其命名为AspergilluscervinusZJOU-AC2。

表2　突变菌株遗传稳定性实验结果Table 2　Experimental results of genetic stability ofmutant strains

2.2.4突变菌株ZJOU-AC2在发酵培养基上的产酶曲线测定

由图5可知，原始菌株ZJOU-AC1在0～96 h内壳聚糖酶活力随着时间的增加而增加，在96 h时壳聚糖酶活力达到最大值8.26 U/mL。突变菌株 ZJOU-AC2与ZJOU-AC1的产酶曲线趋势相同，在90 h时壳聚糖酶活力达到最大值12.37 U/mL。从图中的2条产酶曲线可以看出,ZJOU-AC2产壳聚糖酶活力峰值时间比ZJOU-AC1减少了6 h，且酶活力是ZJOU-AC1的1.49倍。说明冷源等离子体诱变后可以减少鹿皮曲霉的发酵时间，提高发酵效率，具有很好的实际应用性。

图5　发酵时间对壳聚糖酶活力的影响Fig.5　Effect of fermentation time on chitoanase activity

2.3　突变菌株ZJOU-AC2发酵条件单因素试验

2.3.1发酵温度对壳聚糖酶活力的影响

发酵温度对突变菌株ZJOU-AC2的影响结果如图6所示，随着发酵温度的提高，壳聚糖酶活力逐渐增大，在30 ℃时酶活力达到最大值12.36 U/mL，随后酶活力开始下降。由于菌体对温度较为敏感，温度过高或过低都会使其生命活动能力和酶活力下降，不利于微生物的生长代谢。

图6　发酵温度对壳聚糖酶活力的影响Fig.6　Effect of fermentation temperature on chitoanase activity

2.3.2初始pH值对壳聚糖酶活力的影响

由于发酵培养过程中菌体的生命活动，pH值一直在变化，不易控制，因此本实验只考虑初始pH值对壳聚糖酶活力的影响。结果由图7可知，壳聚糖酶活力在初始pH值5.5～6.5范围内较为理想。当发酵液的初始pH值为6.0时，酶活力最高，为12.43 U/mL。发酵过程中pH值的大小会影响菌体对壳聚糖的利用和壳聚糖酶的活力。

图7　初始pH值对产壳聚糖酶活力的影响Fig.7　Effect of initial pH on chitoanase activity

2.3.3发酵时间对壳聚糖酶活力的影响

图8中，发酵时间在80～100 h时，酶活力较好；在90 h时，壳聚糖酶活力达到峰值为12.45 U/mL。推测是因为在发酵初期，培养基内的营养物质充裕，菌体大量繁殖，产生大量的壳聚糖酶，后期培养基内的营养物质减少，同时菌体处于衰亡期，菌体数量开始减少，故壳聚糖酶的生产也相应减少。

图8　发酵时间对产壳聚糖酶活力的影响Fig.8　Effect of fermentation time on chitoanase activity

2.3.4接种量对壳聚糖酶活力的影响

图9所示，接种量在2%～4%时，有利于壳聚糖酶的合成。接种量在1%～3%时，酶活力逐渐升高，在3%的接种量时酶活力最高，为11.41 U/mL。当接种量大于3%，酶活力开始下降。推测当接种量在1%～3%时，随着接种量的增加，菌体繁殖速度加快，产壳聚糖酶的能力也相应增加，当接种量大于3%后，菌体需要的能量大于培养基能提供的能量，由于营养物质匮乏导致壳聚糖酶活力下降。

图9　接种量对产壳聚糖酶活力的影响Fig.9　Effect of inoculum on chitoanase activity

2.3.5正交试验结果

结合单因素试验的结果，以发酵温度、初始pH值、发酵时间、接种量为因素，设计四因素撒水平正交试验。结果如表3所示，极差R值大小顺序为：RB>RD>RA>RC，说明初始pH值对壳聚糖酶活力影响最大，其次是接种量、发酵温度、发酵时间。K值分析结果显示，4个因素的最优组合为A2B2C1D2，即发酵温度为30 ℃，初始pH值为6.0，发酵时间为80 h，接种量为3%。根据此组合进行发酵实验验证(设置3个平行组)，得出最终酶活力为14.28±0.08 U/mL，高于正交试验中所有的组合结果，说明该组合确实为最佳发酵条件。

表3　L9(34)正交试验结果Table 3 The result of L9(34) orthogonal test

3　结论

(1)冷源等离子体诱变筛选高产壳聚糖酶突变菌株的参数是：电压为40 kV、辐照时间为90 s。筛选出一株酶活力提高50.7%的突变菌株，命名为鹿皮曲霉(Aspergilluscervinus)ZJOU-AC2。

(2)突变菌株鹿皮曲霉(Aspergilluscervinus)ZJOU-AC2正交试验结果表明：最佳培养条件为发酵温度30 ℃，初始pH 6.0，发酵时间为80 h，接种量为3%，比优化前提高了15.07%。

(3)本研究使用冷源等离子体诱变鹿皮曲霉筛选突变菌株，具有方法简便、诱变效率高的特点，表明此诱变方法具有很强的应用潜力。

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