抑制Akt／PKB信号通路促进缺氧诱导的人牙周膜成纤维细胞凋亡

刘惠莉

牙周炎是一类高发性的口腔炎症疾病，严重危害人类口腔健康，并与全身健康和诸多疾病有着密切的关系，在全球有着极高的发病率［1］。

近年来研究发现牙周炎主要是厌氧菌的混合感染，缺氧环境更有利于厌氧型致病菌的生长和繁殖，因此缺氧环境会加重牙周炎病变过程，影响牙周组织的防御和修复，并直接诱导牙周组织细胞的凋亡［2］。牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）是牙周组织内的主要组成成分，其生物活性与牙周炎的发生密切相关［3］。

缺氧诱导的hPDLFs凋亡与牙周炎密切相关［4］。缺氧诱导因子-1（HIF-1）由α和 β两个亚基组成，HIF-1α蛋白在细胞核中表达，常氧条件下迅速降解。在缺氧的条件下，HIF-1α含量则显著提高，与含缺氧反应元件的下游基因结合，激活缺氧应答基因调控系统的缺氧应答反应［5］。

本文主要研究在缺氧条件下，抑制Akt／PKB信号通路对hPDLFs凋亡的影响，为进一步阐明牙周炎的发病机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与仪器

hPDLFs（BioWhittaker公司，美国）；DMEM培养基（Gibco公司，美国）；厌氧产气袋AnaeroPack（三菱公司，日本）；FITC-Annexin V、Propidium Iodide（BD Biosciences Pharmingen公司，美国）；Lipofectamine 2000转染试剂盒、si-Akt、si-control（Introvigen公司，美国）；Fast SYBR Green mastermix kit（Applied Biosystems公司，美国）；HIF-α单抗、pAktser473单抗、t-Akt单抗、βactin抗体及酶标二抗（CST公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，FACSCalibur，美国）；PCR仪 （ABI公司，9700，美国）。其他常用试剂购自上海生工公司。

1.2 细胞培养

从液氮中快速取出hPDLFs，复苏后，用含有4 ml DMEM培养基的25 cm2的培养瓶在37℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后更换培养基继续培养。

1.3 细胞缺氧处理

将hPDLFs接种入培养瓶，放入厌氧产气袋AnaeroPack，产生CO2，减少氧气含量至1%左右，扎口密封，放入细胞二氧化碳培养箱培养48 h。

1.4 细胞转染

取hPDLFs以7.5×104／孔的密度接种于6孔板中，5%CO2、37℃的培养箱中进行培养4 h。采用Lipofectamine 2000转染试剂盒转染，分别将si-Akt和si-control转染至细胞中，转染48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

取稳定转染和缺氧48 h处理的hPDLFs，培养48 h后收集并消化细胞，接种在6孔板中，PBS洗涤3次，使用500μl binding buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×105／孔，各孔加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI混匀，室温避光放置10 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.6 qRT-PCR

取稳定转染和缺氧48 h处理的hPDLFs常规培养，用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA。以提取的RNA为模板，反转录成cDNA。加入荧光染料SYBR Green，在ABI 7900 qRT-PCR系统，以U6 snRNA为相对定量的内参进行HIF-1α蛋白mRNA的扩增。

1.7 Western blot检测蛋白表达

取稳定转染和缺氧48 h处理的hPDLFs，培养48 h后消化收集，加入RIPA裂解液提取总蛋白，进行12%的SDS-PAGE电泳，将分离的蛋白转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，将单抗HIF-α、p-Akt、t-Akt、Bcl-2、Bax在4℃条件下孵育过夜，加入二抗（辣根过氧化物酶标记），室温孵育1 h，ECL显影检测蛋白表达。

1.8 MTT法检测细胞增殖

取稳定转染和缺氧48 h处理的hPDLFs进行消化收集，以1×105／孔的密度接种于96孔板中，37℃、5%CO2条件下分别培养12、24、48、72 h后，加入10 μl MTT溶液，孵育4 h后，弃掉培养液，每孔加入150μl DMSO荡摇匀后，酶标仪检测490 nm的吸光值。

1.9 统计分析

2 结 果

2.1 缺氧抑制hPDLFs的增殖

在12、24、48、72 h时，缺氧组的细胞增殖率明显低于常氧组（P＜0.05）（图 1）。

图1 缺氧抑制hPDLFs增殖Fig 1 Proliferation inhibition of hPDLFs by hypoxia

2.2 缺氧促进hPDLFs凋亡

与常氧组相比，缺氧组的hPDLFs的凋亡率明显提高（图2A、2B）。缺氧组的Bax蛋白表达量明显提高，Bcl-2蛋白表达量明显降低，Bax／Bcl-2的比值明显提高（图2C）。说明缺氧显著促进hPDLFs凋亡。

2.3 缺氧促进HIF-1α蛋白的表达

缺氧组的HIF-1α表达量明显高于常氧组（图3A），而HIF-1α的mRNA表达没有明显的变化（图3B）。结果说明缺氧显著促进HIF-1α的蛋白表达。

2.4 缺氧抑制Akt／PKB信号通路

与常氧组相比，pAktser473的表达量明显降低，而总Akt的表达量没有明显变化（P＜0.05），说明缺氧明显抑制了Akt／PKB信号通路（图4）。

2.5 抑制 Akt／PKB信号通路促进缺氧条件下HIF-1α的蛋白表达

在缺氧条件下，si-Akt明显降低了pAktser473的表达，而总Akt的表达量没有明显变化，si-Akt抑制了Akt／PKB信号通路（图 5）；在缺氧条件下，si-Akt组的HIF-1α蛋白表达明显高于si-control组，说明si-Akt显著抑制Akt／PKB信号通路，且明显提高了缺氧条件下HIF-1α蛋白的表达（图5）。

2.6 抑制Akt／PKB信号通路增强缺氧对的hPDLFs增殖的抑制

将si-Akt和 si-control转染 hPDLFs以研究 Akt／PKB信号通路抑制对hPDLFs增殖的影响。结果显示，在缺氧条件下，si-Akt组的hPDLFs增殖抑制率明显高于si-control组，且在24、48、72 h时有统计学差异（图6）。说明抑制Akt／PKB信号通路促进缺氧对hPDLFs增殖的抑制。

图2 缺氧诱导hPDLFs的凋亡Fig 2 Apoptosis of hPDLFs induced by hypoxia

图3 缺氧提高hPDLFs HIF-1α蛋白的表达Fig 3 HIF-1αexpression in hPDLFs

图4 缺氧抑制Akt／PKB信号通路Fig 4 Inhibition of Akt／PKB signaling pathway by hypoxia

2.7 抑制 Akt／PKB信号通路促进缺氧诱导的 hPDLFs的凋亡

在缺氧条件下，与 si-control对照组相比，si-Akt组的 hPDLFs凋亡率 明显提高（P＜0.05）（图 7A）。Westernblot结果表明，与si-control组相比，si-Akt组的Bcl-2蛋白表达量明显减少，Bax蛋白表达量明显增加，Bax／Bcl-2的比值明显提高（图 7B）。说明抑制Akt／PKB信号通路显著促进缺氧诱导hPDLFs的凋亡。

图5 抑制Akt／PKB信号通路促进缺氧诱导的HIF-1α蛋白表达Fig 5 Promotion of HIF-1αexpression by the inhibition of Akt／PKB signaling pathway hypoxic-induced reduction of HIF-1αlevel

图6 抑制Akt／PKB信号通路增强缺氧诱导的hPDLFs增殖抑制Fig 6 Increase of the inhibition of hypoxia induced proliferation of hPDLFs by inhibition of Akt／PKB signaling pathway

3 讨 论

图7 抑制Akt／PKB信号通路促进缺氧诱导的hPDLFs的凋亡Fig 7 Increase of hypoxia-induced apoptosis of hPDLFs by the inhibition of Akt／PKB signaling pathway

细胞凋亡是在正常生理或病理状态下机体细胞发生的一种自发的、程序化的死亡过程，是细胞缺氧诱导细胞损伤的主要形式。细胞在缺氧条件下，细胞核中HIF-1α蛋白显著增加，引发一系列细胞缺氧反应［6］。本研究发现hPDLFs在缺氧条件下的凋亡率明显高于常氧条件下的凋亡率，说明缺氧促进了hPDLFs的凋亡，且缺氧条件下的HIF-1α蛋白表达量明显增加，HIF-1α mRNA没有明显的变化，常氧条件下几乎无HIF-1α的表达。研究表明缺氧对HIF-1αmRNA水平没有影响，但可以显著影响蛋白水平变化，可能是对转录后水平的调控。在缺氧的条件下，细胞核中HIF-1α蛋白显著增加，同时HIF-1β亚基从胞浆转移入细胞核中，与细胞核中的HIF-1α形成异二聚体。HIF-1异二聚体与含缺氧反应元件的下游基因结合，激活缺氧应答基因调控系统的缺氧应答反应，引发一系列细胞缺氧反应［7］。

Akt／PKB参与了多个细胞过程。SARS冠状病毒膜蛋白通过激活caspase-8和caspase-9并抑制PDK1与Akt／PKB信号通路的相互作用诱导细胞凋亡［8］。环氧化酶抑制剂SC236通过下调Akt的表达和上调Cyt-C的表达诱导胃癌细胞的凋亡［9］。Baran等［10］发现Akt／PKB信号通路可以作为介导小鼠胚胎细胞抗凋亡信号的主要靶标。在本研究中，实验结果证明缺氧显著促进hPDLFs的凋亡，抑制细胞增殖，抑制Akt／PKB信号通路，并且抑制Akt／PKB信号通路显著促进缺氧诱导的hPDLFs的凋亡，增强缺氧诱导的hPDLFs增殖抑制，提高HIF-1α蛋白的表达，为牙周炎发病机制的进一步研究提供了理论依据。

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