散发性结直肠癌患者错配修复蛋白表达情况以及微卫星不稳定性与Rb蛋白表达的相关性研究

陈浩林，彭昌兵，杜镇鸿，魏　贤

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，居恶性肿瘤发病的第4位。据相关数据表明，结直肠癌的发病率有逐年上升的趋势，严重威胁着人们的健康和生活质量[1-2]。结直肠癌的发生过程十分复杂，同时牵涉多个肿瘤相关基因的参与[3-4]。临床研究发现，参与结直肠癌发生的分子途径主要有染色体不稳定性(CIN)与微卫星不稳定性(MSI)[5]。而在结直肠癌患者中CIN途径占80%左右，而导致CIN发生因素主要为癌基因和抑癌基因突变，经过多阶段、多因素而致癌[6]。MSI主要是由错配修复基因缺陷造成，目前发现的错配修复蛋白(MMRP)共有7种，但主要研究其中4种(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)，而这些蛋白水解后的产物均为核酸水解酶，这种水解酶能纠正DNA复制过程中错配的碱基，使基因在复制过程中更具有保真性[7-8]。此外，还有研究表明错配修复基因与肿瘤患者某些临床病理特征存在一定的相关性[9]。因此，本文以60例散发性结直肠癌作为研究对象，研究MMRP表达以及MSI与视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白表达的相关性。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2013年1月—2016年1月我院存档的手术切除散发性结直肠癌标本60例，其中男32例，女28例；年龄36～69(49.51±8.41)岁。①纳入标准：根据患者临床症状以及相关病理检查，确诊为散发性结直肠癌。②排除标准：符合Amsterdam Ⅱ诊断标准的遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)；在手术前行放化疗的患者。

1.2研究方法标本采用10%甲醛固定、常规脱水、取材、石蜡包埋、HE染色。根据HE切片选取病灶区域，用记号笔定位。用采样针从标记好的蜡块组织中取2～4 mm长的组织条，打入42孔(6×7)蜡块微阵列中。其中第1行后2个孔作为空白对照及定位标识。

1.3指标检测采用免疫组织化学染色法对MLH1、PMS2、MSH2、MSH6以及Rb蛋白进行染色，采用罗氏全自动免疫组化仪执行；MLH1、PMS2、MSH2、MSH6以及Rb抗体均由中杉金桥公司提供。将4种MMRP中的1种以上表达阴性定为MSI。

1.4判断标准每张切片选取阳性率高的区域10个高倍视野，每个视野计数100个细胞。①MMRP各蛋白表达检测：MLH1、PMS2、MSH2和MSH6均在细胞核内表达，采用半定量积分法检测。阳性检测评分标准：0分表示无阳性细胞、1分表示阳性细胞占≤10%、2分表示阳性细胞占10%～50%、3分表示阳性细胞占50%～80%、4分表示阳性细胞所占比例>80%。染色强度评分标准：0分为无色、1分为浅黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色。两项评分相乘为最终评分，最终评分为0分表示蛋白缺失、1分表示为蛋白低表达、≥2分表示蛋白阳性表达，缺失与蛋白低表达按照阴性表达计算。②Rb蛋白表达检测：Rb蛋白在细胞核中表达，表达阳性表示细胞核呈黄色或棕黄色。

2　结果

2.1MMRP和Rb蛋白的表达情况MLH1阳性54例，阴性6例；PMS2阳性52例，阴性8例；MSH2阳性59例，阴性1例；MSH6阳性58例，阴性2例；MSI患者10例(16.67%)。Rb蛋白阴性表达25例(41.67%)，阳性表达35例(58.33%)。

2.2MSI和Rb蛋白表达与临床特征的关系MSI与年龄、肿瘤部位、Dukes分期、肿瘤直径、淋巴结转移、组织类型存在相关性(P<0.05)。Rb蛋白表达与组织类型、远处转移、浸润深度、大体分型存在相关性(P<0.05)。见表1。

2.3相关性分析MSI患者Rb蛋白表达阴性4例、阳性6例。经Spearman相关分析显示，MSI与Rb蛋白表达呈正相关(r=0.427，P<0.001)。

3　讨论

目前有关结直肠癌的发病原因尚未完全清楚，但有文献报道，结直肠癌的发病机制与KRAS基因突变有关，检测其表达情况对结直肠癌的诊断与治疗具有一定的价值[10]。而临床上研究最多的结直肠癌是HNPCC，且结果表明其与错配修复基因的种系发生突变有着密切的相关性，并且有接近15%的HNPCC与散发性结直肠癌患者有着相同的发病机制[11]。近年随着医疗技术的发展，临床研究逐渐向更细化方向进行，MMRP是目前临床上关注的热点，其在生物进化过程中充当着重要的角色[12-13]。人体DNA的复制是一项十分精细的过程，在此过程中往往会有碱基错配情况发生，此时引发MMRP的表达，来识别与修复错配的碱基，从而维持基因组的稳定性，若是MMRP发生缺陷导致不能完整表达和修复错配的碱基时，会使DNA突变频率加快，从而导致肿瘤的发生[14-16]。

MMRP总共有7种，但是目前临床上研究最多的是MLH1和MSH2，其表达的缺失与自身甲基化的发生有着密切的关系，并且这两种蛋白的表达情况对MSI有较好的预测价值[17-18]。国外学者Pai等[19]研究表明，在子宫内膜癌患者中约有20%的患者存在MLH1蛋白的缺失，并且缺失率明显高于PMS2蛋白。于鹏飞等[20]学者研究证明，散发性结直肠癌存在MLH1、MSH2、MSH6蛋白的高度缺失，并且其表达水平与患者的临床病理参数存在明显的相关性。本研究结果显示，其中MLH1阳性54例，阴性6例；PMS2阳性52例，阴性8例；MSH2阳性59例，阴性1例；MSH6阳性58例，阴性2例；MSI患者10例(16.67%)；提示4种蛋白的突变情况与散发性结直肠癌的发生、发展有着密切的相关性。而于静等[21]学者研究显示，不同地区的散发性结直肠癌患者缺失蛋白所占的比例有所不同，且发生突变的基因也有所不同。本研究还表明，MSI与年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、淋巴结转移、Dukes分期、组织类型存在相关性。这与彭俊玲等[22]和赵喜连等[23]学者的研究结果相似。

表1　MSI和Rb蛋白表达与散发性结直肠癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

注：MSI为微卫星不稳定性，Rb为视网膜母细胞瘤

Rb蛋白是1986年才分离出现的第一个抑癌基因，分为非磷酸化与磷酸化两种形式。非磷酸化时为Rb蛋白的活化形式，对细胞的生长起到负调节作用。磷酸化Rb蛋白主要是让分裂后的子细胞处于G1期，抑制肿瘤细胞的转移，是目前临床上判断肿瘤是否发生转移的重要指标。而相关临床研究已证实在乳腺癌组织中能检测到Rb蛋白[24]。本研究结果显示，Rb蛋白表达与大体分型、组织类型、远处转移、浸润深度存在相关性，提示Rb蛋白对肿瘤发生和转移具有预测作用。郑文等[25]研究也表明，Rb蛋白的表达与肿瘤的转移、浸润具有密切的相关性，对肿瘤预后具有重要的评估价值。且本研究还表明，MSI与Rb蛋白表达呈正相关，表明在临床上可通过检测Rb蛋白的表达情况评估MSI散发性结直肠癌患者的预后情况。

综上所述，在散发性结直肠癌患者中存在MMRP缺失，并且MLH1、PMS2缺失较MSH2和MSH6多见；MSI与Rb蛋白表达呈正相关，且与散发性结直肠临床病理特征关系密切，对散发性结直肠癌的预测以及恶性程度的评估具有参考价值，可能参与散发性结直肠癌的发生、发展过程。

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