miRNA-99b负调控mTOR抑制脑胶质瘤细胞的侵袭能力

马鹏举，汲乾坤，李祥生，常海刚，周文科，金保哲

(新乡医学院第一附属医院神经外科，河南 新乡　453100)

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性的恶性肿瘤，呈侵袭性生长、复发率高的特点，其预后较差。脑胶质瘤的本质上是一种多基因异常疾病，其分子机制可能是由于抑癌基因的突变缺失及原癌基因的过表达，导致胶质瘤细胞逃避了正常的调控机制，故胶质瘤相关的异常基因及其作用机制仍为当前的研究热点[1]。

miRNA是20～25个核苷酸大小的非编码蛋白的小分子RNA，miRNA 可互补结合靶mRNA 3′非编码区(untranslated region, UTR)端，导致靶mRNA的降解或翻译抑制，其在转录后的水平对靶基因表达形成负调控[2]，影响细胞增殖和凋亡等生物学行为[3-4]。miRNA-99b属于miRNA-99基因簇，该基因簇的多个成员被证实与肿瘤的发生、发展密切相关[5-7]。哺乳动物雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其表达异常与肿瘤细胞的迁移、侵袭以及肿瘤的复发和耐药相关[8]。最新研究表明[9]，miRNA-99b在脑胶质瘤中表达降低，可能与脑胶质瘤发生、发展有关，但其在脑胶质瘤中具体靶点尚不明确。本实验通过前期预实验及文献支持，推测miRNA-99b对脑胶质瘤的作用可能是通过靶向调控mTOR。故本研究旨在探讨miRNA-99b对脑胶质瘤U251细胞侵袭的影响及调控mTOR作用机制，以期为胶质瘤的治疗寻找新的分子靶点。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1临床标本收集新乡医学院第一附属医院自2010年1月至2015年12月手术切除，术后病理证实为脑胶质瘤的标本共36例，其中23例男性，13例女性，年龄18～60岁，平均45.9岁。根据WHO 2007对神经系统肿瘤分类标准进行分级，其中13例低级别脑胶质瘤：包括9例WHOI～II级低级别星形细胞瘤和WHO II级4例少突胶质细胞瘤；23例高级别胶质瘤：包括11例WHO III级间变性星形细胞瘤和12例WHO IV级胶质母细胞瘤。正常对照组：8例正常脑组织(颅脑外伤手术切除)。

1.1.2细胞与试剂脑胶质瘤U251细胞为本实验室保存。胎牛血清和DMEM培养基购自美国HyClone公司；逆转录、real-time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；miRNA-99b引物、miRNA-99b模拟物(5′-CACCCGUAGAACCGACCUUGCG-3′)、Lipofectamine 2000转染试剂，购自上海吉凯生物科技公司；mTOR引物、质粒及其内参β-actin由武汉博士德公司合成；mTOR及内参一抗购自美国CST公司；含铺有Matrigel基质胶的Transwell小室购自美国Corning公司；mTOR野生型及突变型PsiCHECK荧光报告载体购自广州锐博生物科技公司。

1.1.3仪器CO2细胞培养箱、低温高速离心机、转膜仪、生物安全柜(美国Thermo公司)，荧光定量PCR仪器(美国Life公司)，激光共聚焦显微镜(日本OLYMPUS公司)，倒置相差显微镜(日本Nikon公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，精密电子天平(德国Sartorious公司)。

1.1　方法

1.2.1细胞培养及转染用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养脑胶质瘤U251细胞，选取对数期生长的活力较好的细胞种板，按Lipo2000说明书进行转染。miRNA-99b mimics转染实验分3组：空白对照组(Blank)、阴性对照组(mimics control)和miRNA-99b mimics组；mTOR 质粒转染实验分为3组：空白对照组(Blank)、阴性对照组(negative control)和mTOR PsiCHECK组。

1.2.2real-time PCR检测脑胶质瘤组织及细胞中相关mRNA的表达TRIzol法提取组织、细胞的总RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，扩增体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL ，cDNA模板 1μL，上、下游引物各0.5 μL，加无核酶水补充至20 μL，于95℃ 30s，95℃ 5s、60℃ 30s，进行35次循环。采用2-⊿⊿Ct法计算miRNA-99b、mTOR mRNA的表达水平。靶基因miRNA-99b的引物：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游5′-TCACCCGTAGAACCGACCTT-3′，及其内参U6的引物：上游5′-CGCAAGGATGACACG-3′，下游5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′。靶基因mTOR的引物：上游5′-GCGAACCTCAGGGCAAGAT-3′，下游5′-TGACTCATCTCTCGGAGTTCCA-3′，其内参β-actin的引物：上游5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ ，下游5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′。

1.2.3Transwell实验检测转染后U251细胞侵袭能力的变化预热铺有Matrigel胶的Transwell小室至37℃，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的培养液。上室中加入含1×105个U251细胞的单细胞悬液，培养24 h后弃上室液体，用棉签擦去上室面未穿过膜的细胞，固定风干后用0.1 %的结晶紫染色20 min。 400倍下计数5个视野中黏附细胞数的平均值，每组设4个复孔。

1.2.4荧光素酶报告基因检测系统检测miRNA-99b对mTOR的调控取对数生长期的U251细胞，按5×104个细胞/孔接种于6孔板中。用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，待细胞融合度为70%左右时，按转染试剂说明书分别将miRNA-99b mimics和wt mTOR 3′-UTR、mimics control和wt mTOR 3′-UTR、miRNA-99b mimics和mut mTOR 3′-UTR、mimics control和mut mTOR 3′-UTR共转染至U251细胞。转染48 h后，按试剂盒说明书提供的方法检测上述细胞的相对荧光强度值。

1.2.5Western blot法检测转染后U251细胞中mTOR蛋白的表达水平将蛋白提取缓冲液加入转染后的U251脑胶质瘤细胞中，反应后测定裂解液的蛋白浓度，根据浓度进行每孔上样，于10% SDS-PAGE的胶中进行电泳，转膜，将膜放置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭，加入mTOR一抗、二抗依次孵育，暗室进行显影、定影。

1.2.6预后随访全部胶质瘤术后患者，随访时间：12～53个月。随访后记录患者总生存期(overall survival，OS)，观察脑胶质瘤患者miRNA-99b表达水平与OS的关系。

2　结果

2.1脑胶质瘤组织中miRNA-99b及mTOR的相对表达水平Real-time PCR检测高、低级别脑胶质瘤及正常脑组织中miRNA-99b和mTOR的表达水平。如Fig 1所示，miRNA-99b mRNA随胶质瘤恶性程度的增高而表达明显减少(F=836.3，P<0.05)；而高级别脑胶质瘤中mTOR mRNA表达水平较对照组明显增高，随胶质瘤恶性程度的增高而表达增高(F=136.4，P<0.05)。

2.2转染miRNA-99b模拟物后U251细胞miRNA-99b的表达水平Fig 2的real-time PCR检测结果显示，与Blank组和mimics control组比较，miRNA-99b mimics组细胞miRNA-99b的表达水平明显升高，差异有统计学意义(F=19.85，P<0.01)。

2.3转染miRNA-99b模拟物后对U251细胞侵袭能力的影响Fig 3的Transwell实验结果显示，与对照组比较，miRNA-99b mimics组的穿膜细胞数明显减少，差异有统计学意义(F=52.75，P<0.01)。

Fig 1　Expressions of miRNA-99b (A) and mTOR mRNA(B)in glioma tissues and normal brain tissues

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vslow grade

Fig 2　Expression levels of miRNA-99b in U251 cells after transfection with miRNA-99b mimics

**P<0.01vsblank group

2.4miRNA-99b靶基因预测与荧光素酶实验结果分别将miRNA-99b mimics和wt-mTOR 3′-UTR、mimics control和wt- mTOR 3′-UTR、miRNA-99b mimics和mut-mTOR 3′-UTR、mimics control和mut- mTOR 3′-UTR共转染至U251细胞后，应用荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。Fig 4结果显示，miRNA-99b mimics和wt-mTOR 3′-UTR共转染组的荧光强度值明显低于mimics control和wt-mTOR 3′-UTR共转染组(P<0.05)，而miRNA-99b mimics和mut-mTOR 3′-UTR共转染组与mimics control和mut-mTOR 3′-UTR共转染组荧光强度值之间比较无统计学意义。这一结果说明，miRNA-99b可调控mTOR的表达。

Fig 3　Effects of transfection after miRNA-99b mimics on invasion of U251 cells(×400)

A: U251 cells without any transfection; B: U251 cells were transfected with mimics control; C: U251 cells were transfected with miRNA-99b mimics; D: miRNA-99b mimics inhibited U251 cells invasion.**P<0.01vsblank group

Fig 4　U251 cells co-transfected with miRNA-99b mimics and wild-type(A) or mutant(B) mTOR 3′-UTR, and GFP intensity measured by the EGFP reporter assay

*P<0.05vsmimics control+wt- mTOR 3′-UTR group

2.5转染miRNA-99bmimics后U251细胞mTOR的表达水平Fig 5A的real-time PCR检测结果显示，与Blank组和mimics control组比较，miRNA-99b mimics组细胞中mTOR mRNA的表达水平明显降低，差异有统计学意义(F=11.95，P<0.01)。Fig 5B的Western blot结果显示，转染miRNA-99b mimics组mTOR 蛋白表达水平较mimics control组和Blank组明显降低(F=5.44，P<0.01)，Blank组与miRNA control组相比差异无统计学意义。

Fig 5　The expression levels of mTOR mRNA(A)and protein(B) in U251 cells after transfection with miRNA-99b mimics

**P<0.01vsblank group

2.6转染mTOR质粒后U251细胞miRNA-99b的表达水平Fig 6的real-time PCR结果显示，转染mTOR表达质粒后，mTOR mRNA表达明显升高，两组间差异有统计学意义(P<0.05)；但miRNA-99b表达水平不受mTOR变化的影响，两组差异无统计学意义。

Fig 6　The expression levels of mTOR mRNA and miRNA-99bevaluated by real-time PCR in U251 cells after transfected with PsiCHECK/mTOR

*P<0.05vsmimics control group

2.7转染mTOR质粒对U251细胞侵袭能力的影响如Fig 7所示，脑胶质瘤U251细胞转染miRNA-99b mi+ PsiCHECK/mTOR后，与对照组比较，其脑胶质瘤U251细胞的侵袭能力明显升高(P<0.01)，表明恢复mTOR表达后，mTOR能明显恢复因miRNA-99b抑制的细胞侵袭能力。

2.8miRNA-99b的表达水平对胶质瘤患者预后的影响Fig 8 Kaplan-Meier生存分析显示，低表达miRNA-99b的胶质瘤患者的平均总生存期为18.5月，而高表达组miRNA-99b的胶质瘤患者平均总生存期为35.0月，miRNA-99b的单变量分析显示, miRNA-99低表达患者的总生存期明显低于高表达组，两组差异有统计学意义(P<0.01)。

3　讨论

脑胶质瘤恶性程度高，手术联合术后的放化疗后胶质瘤的预后仍较差，而目前找寻基因水平的治疗靶点是脑胶质瘤研究的主要方向。miRNA具有广泛的基因调节功能，许多研究发现，miRNA在脑胶质瘤中表达异常，认为脑胶质瘤的发生、发展可能与miRNA关系密切[3,10]。

miR-99家族是miRNA 家族中进化最原始的一组miRNA，它们调控的靶基因多参与细胞的增殖、分化、转移和凋亡[11]。研究发现，miRNA-99b在多种肿瘤中表达水平下调[9]，提示其在肿瘤中可能起到抑癌基因的作用，调控肿瘤的发生和发展。研究发现[6]，在乳腺癌细胞中，miRNA-99b通过下调转化生长因子β的表达，导致乳腺癌上皮间质转化，并可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。上调miRNA-99b表达可影响DNA的修复，从而增加肿瘤细胞对放疗的敏感性[12]。以上研究表明，miRNA-99b对肿瘤的发生发展、预后可能起到非常重要的作用。miRNA-99b在脑胶质瘤中表达较正常脑组织低[9]，但miRNA-99b对脑胶质瘤的影响及相关下游机制尚不清楚，需要进一步验证。

Fig 7　Cell invasion ability in U251 cells after transfected with PsiCHECK /mTOR showed by Transwell assay

A: U251 cells were transfected with miRNA-99b and PsiCHECK /mTOR; B: U251 cells were transfected with miRNA-99b and PsiCHECK control; C: mTOR mimics restore U251 cells invasion.**P<0.01vsPsiCHECK/mTOR group

Fig 8　Comparison of OS between miRNA-99b high expression group and low expression group in human gliomas

本研究首先发现脑胶质瘤组织中miRNA-99b的表达水平较其癌旁正常组织明显降低，得出miRNA-99b在脑胶质瘤组织中呈低表达，并且通过进一步实验将miRNA-99b mimics转染入脑胶质瘤U251细胞中，经real-time PCR实验证实U251细胞中的miRNA-99b表达水平明显升高，表明转染成功。Transwell侵袭实验结果显示，miRNA-99b的表达水平上调后， U251细胞的细胞侵袭能力明显受抑制。Kaplan-Meier 生存分析显示，miRNA-99b高表达的胶质瘤患者的平均总生存期明显高于低表达miRNA-99b患者。综上表明miRNA-99b对脑胶质瘤的发展有重要的作用。

为了进一步探讨miRNA-99b对脑胶质瘤细胞的作用及其机制，首先生物信息学预测发现， mTOR在脑胶质瘤中可能作为miRNA-99b的靶基因，我们进一步通过荧光素酶实验验证。结果表明，转染miRNA-99b模拟物后，mTOR-MUT报告载体的荧光强度基本不受影响，而mTOR-WT报告载体的荧光强度受到明显影响，表明mTOR mRNA的3′UTR上存在miRNA-99b的结合位点，说明mTOR是miRNA-99b下游靶基因。

mTOR是1个保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，其信号转导通路失去正常功能可诱发各种疾病及肿瘤的产生，目前研究表明，mTOR 信号通路在肿瘤细胞的恶性生物学表型中起重要作用。其发挥作用可能的主要方式包括：在细胞的生长增殖凋亡等过程中发挥着重要功能，参与细胞内的某些重要的信号转导过程等[13]。研究发现mTOR与肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生、发展、预后密切相关[14]，而mTOR在脑胶质瘤作用的具体调控机制尚不清楚。本研究检测在脑胶质瘤组织中行real-time PCR实验，在脑胶质瘤组织中mTOR的表达水平较其正常脑组织明显升高，进一步上调miRNA-99b的表达水平发现，脑胶质瘤U251细胞中mTOR的mRNA及蛋白表达水平明显下降。我们研究发现上调mTOR的表达，不影响miRNA-99b的表达水平，表明miRNA-99b对mTOR的调控作用是单向的，而上调mTOR的表达后，被miRNA-99b抑制的胶质瘤细胞的侵袭能力明显恢复。综上表明，上调miRNA-99b可能是通过抑制mTOR，进而抑制脑胶质瘤细胞的侵袭能力。

综上所述，在脑胶质瘤组织中miRNA-99b呈低表达，miRNA-99b过表达明显抑制脑胶质瘤U251细胞侵袭，并可能是通过介导mTOR实现的。因此，在脑胶质瘤中miRNA-99b可能作为一种抑癌基因，并可能为脑胶质瘤的基因治疗提供了新的思路靶点。

(致谢：本实验主要在新乡医学院第一附属医院河南省神经病学研究所完成，感谢实验室全体工作人员对本实验的大力协助。)

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