人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

刘 莎 刘俊骞 郑彦茹 宫 蕊 初丽敏 魏树林

1.石家庄市第三医院，河北石家庄 050011；2.河北医科大学第一医院，河北石家庄 050031；3.石家庄市急救中心，河北石家庄 050000

间充质干细胞是一种干细胞，主要源自发育早期的中胚层，分布于脐血、脂肪以及骨髓等组织之中，既可以自我更新，也可以高度增殖，还能分化成脂肪细胞、成骨细胞以及神经细胞，这种多项分化潜能使得间充质干细胞成为基因治疗及替代治疗领域中有着极高实用价值的一个细胞来源[1]。然而，现阶段间充质干细胞的来源依然存在争议，原因在于间充质干细胞的经典来源主要为骨髓组织，随着年龄增长间充质干细胞含量与增殖能力也会显著下降[2]。对此，临床尝试将人脐带作为来源，获取免疫源性低且增殖能力强的间充质干细胞。本研究对人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化进行研究。现报道如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料

选取2016年10月～2017年10月期间于本院娩出的正常新生儿，去其羊膜、血管，获取脐带基质，将其剪碎为1.5mm大小的块状留作培养使用。同时，准备产自美国N2培养基与DMEM培养基、胎牛血清与谷氨酰胺、重组碱性成纤维生长因子、重组表皮生长因子、β巯基乙醇、兔康神经微丝抗体、鼠抗β-Ⅲ类微管蛋白抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白抗体，此外还有产自我国的兔抗超蛋白抗体、SABC试剂盒以及产自上海中西药业的丹参注射液，产自日本的RT-PCR试剂盒，产自法国的荧光标记小鼠抗人抗体（CD）。

1.2　方法

1.2.1细胞培养 使用重蒸水配置两种培养基的细胞培养基，在过滤消毒之后加入青霉素、链霉素及二性霉素B各100U/mL进行抗菌处理，随后在DMEM培养基中加入10%胎牛血清与重组表皮生长因子、重组碱性成纤维生长因子各5ng/mL与谷氨酰胺，留作备用。将脐带基质块放到配置好的细胞培养液中，于六孔板中培养，经过培养扩增，其呈贴壁生长，待其省占到融合时传代使用含有抗凝剂的0.25%胰蛋白酶，在37℃下消化，3～5min后进行离心操作，将上清去除，将细胞稀释四五倍后继续进行培养。

1.2.2细胞鉴定 在细胞传代至第3代与第8代时，分别进行1次细胞鉴定，鉴定一起为FACScan流式细胞仪，检查对象为细胞的表面抗原，鉴定目标为人脐带间充质干细胞的生物学特性。

1.2.3诱导分化 在细胞传代至第3代与第8代时为其诱导分化，待细胞贴壁生长密度达到60%时将培养液更换，将诱导剂-丹参注射液、巯基乙醇加入，其中丹参注射液的加入标准为每单位体积细胞培养液加入15mg/mL，4h后将培养液中含有的丹参吸出，以4%多聚甲醛进行细胞固定，留作早期诱导细胞；随后对部分细胞继续进行诱导，观测其细胞形态学变化，在24h后吸去培养液中的丹参，以N2培养基进行24h左右的培养，以4%多聚甲醛进行固定。以巯基乙醇进行诱导，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中加入1mmol/L的巯基乙醇，经过24h的诱导将培养液中的巯基乙醇吸出，观察细胞形态学改变，待改变明显后继续以N2培养基进行固定，以4%多聚甲醛进行固定。

1.2.4免疫细胞学检查与RT-PCR检查 使用兔抗胶质纤维酸性蛋白抗体单克隆抗体、基因Neatin、兔抗神经微丝抗体进行诱导细胞的免疫组化染色，基于SABC试剂盒的相关要求进行操作，进行细胞神经标记。

提取实验细胞的总RNA，通过逆转录获取cDNA，使用PCR仪进行扩增，使其循环得到35个，合成引物，并以1%质量分数的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳显影，照相后分析结果，而半定量标准则参照β-actin[3]。

1.3　观察指标

观察干细胞培养后的生长形态，总结其生物学特性；并且观察间充质干细胞向神经样细胞分化后的基因表达情况-脐带间充质干细胞表面标记、造血细胞表面标记与移植免疫排斥标记。

2　结果

2.1　标记表达

分离自人脐带的贴壁细胞在体外可以生长成类似成纤维细胞的形态，在未分化状态下可以维持稳定增殖形态，且体外增殖远超10代。见表1 ～ 3，这类细胞表面标记CD105、CD59、CD44、CD29有较高的表达，而造血细胞的表面标记CD117、CD45、CD34、CD33、CD28、CD14则无表达或低表达，而与其相同表达的还有移植免疫排斥相关的表面标记，如 CD86、CD80、CD40。

表1　脐带间充质干细胞表面标记检测结果

表2　造血细胞表面标记检测结果

表3　移植免疫排斥标记检测结果

2.2　诱导分化

经诱导分化的细胞表达神经元标记β-III类神经微管和神经微丝、神经干细胞标记巢蛋白、神经胶质细胞标记的胶质纤维酸性蛋白。经过RTPCR检测可知，经丹参诱导后的间充质干细胞表达神经干细胞的相关基因Neatin，而诱导前后间充质干细胞全部表达神经细胞基因Pleiotrophin并且在诱导后表达增强。

3　讨论

干细胞是一种具有较强自我更新能力且存在多种分化潜能的细胞，又被称为祖细胞与前体细胞，其区别于其他组织细胞，具有独特的生物学特性[4]。首先，作为一种未分化细胞，干细胞不具有组织特异性，外源信号若无改变其将一直保持未分化状态，一旦受到特定信号的影响将会分化成不同表型的成熟细胞[5]。其次，其所具备的自我更新能力可以确保其终生存在于所在器官，将其用于体外培养扩增可以用于组织损伤的细胞替代治疗[6]。而中枢神经系统损伤可引发严重功能障碍，现阶段临床并无促进神经再生措施，引导干细胞向神经样细胞分化可以实现神经修复重建的治疗目标[7]。从前文可知，间充质干细胞的主要来源为骨髓组织，但是骨髓中的间充质干细胞含量并不高，每10000个骨髓单核细胞中仅有1个间充质干细胞，而人脐血中虽然也存在间充质干细胞，但是传代培养困难且难以大量获得[8]。而从相关研究可知，脐带基质细胞中含有的干细胞可以获得80倍以上的体外培养增殖，通过各种表达干细胞的标记，可证明胶带基质细胞能够表达神经标记[9]。而通过人脐带间充质干细胞的体外增殖试验可以发现，传代后间充质干细胞经过3～5题可以增殖到4～5倍，及时传代至10代其增值速度也可以保持稳定，细胞形态呈纤维状，与骨髓间充质干细胞相似。结合本研究结果可发现：间充质干细胞的细胞表面标记-CD29、CD59、CD44、CD105均为高表达，并且 CD59的表达＞90%；造血细胞表面标记-CD45、CD34、CD33、CD14、CD117则为低表达，其第3代表达全部低于2%，而第8代表达尚不足1%；移植免疫排斥标记-CD40、CD86、CD80的第8代表达均低于0.3%。这样的结果表示，具有细胞高表达的间充质干细胞相关标记具有稳定的增殖性，其不表达移植排斥与造血细胞，表明间充质干细胞作为一种免疫缺陷细胞可以用于不同个体间的移植。同时，经过RT-PCR检测可知，经丹参诱导后的间充质干细胞表达神经干细胞的相关基因Neatin，而诱导前后间充质干细胞全部表达神经细胞基因Pleiotrophin并且在诱导后表达增强，这意味着经过诱导的人脐带间充质干细胞可以分化为神经样细胞[10]。

人脐带间充质干细胞具有易于培养扩增的生物学特性，无影响则保持稳定，在特定影响下可分化成神经样细胞，这些特性使得其可以用于中枢神经系统损伤的修复治疗。

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