多西环素对心肌梗死模型大鼠缝隙连接蛋白43表达的影响

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心肌梗死是一种常见的心脏疾病，这种疾病的发病机制较复杂，与较多因素有关，心肌梗死后易出现心室重构，心室重构诱发心功能衰竭。在医疗技术迅速发展形势下，心肌梗死病人得到有效治疗，相应的死亡率逐渐降低，但相应的心功能不全发生率未有效降低[1]。心肌梗死对病人的健康造成较大危害，易导致死亡。心脏病发展至一定阶段后易出现心肌梗死，约一半病人可能由于突发致死性室性心律失常导致死亡[2-4]。心肌梗死的发病机制与心肌电重构密切相关，心肌梗死过程出现明显的心肌电生理重构，重构期间产生相应的细胞膜离子通道变化，严重者可能出现相应的细胞间缝隙连接变化。相关研究发现，缝隙连接蛋白43(Cx43)明显影响心肌电生理重构过程，与此相关的研究引起学者关注。很多学者建立心肌梗死动物模型进行研究，模型中发现明显的缝隙连接重构，且表现为一定程度的心肌电生理失稳[5-6]。

心肌梗死后病人心肌多种基质金属蛋白酶(MMPs)活性出现明显变化，其中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性显著升高。这些蛋白酶活性升高后进一步导致心肌梗死后左室重构，造成病人的心功能损害。心肌梗死治疗常用多西环素，该药物属于一种广谱的MMPs抑制剂，其与MMPs活性中心结合，降低MMPs表达水平并降低MMP活性。相关研究发现多西环素可显著抑制MMP-9表达，并对恶性心律失常有一定改善作用，具体机制尚不确定[7]。本研究建立相应的主动脉缩窄性心肌梗死大鼠模型，观察心室肌Cx43表达的变化及多西环素对C43表达的影响。

1　材料与方法

1.1模型制作与分组选择SPF级健康Wistar大鼠，雌雄不限，体重200 g～300 g，均购自广西医科大学动物实验中心。将大鼠分为模型组和假手术组，依据相关文献资料制备相应的心肌梗死大鼠模型，将大鼠固定后备皮，连接心电图之后进行观察。模型组在大鼠左胸第三、四肋间切开1 cm3小口，同时轻提左心耳，之后选择5/0手术线结扎左冠状动脉前降支，关闭胸口缝合处理，观察心电图，若看到相应ST段显著抬高可判断结扎成功。假手术组只穿线，不结扎，手术1个月后检测其血流动力学。对部分模型组大鼠进行多西环素组注射治疗，而对其余心肌梗死组大鼠注入生理盐水，持续时间为4周。

1.2取材配制10%水合氯醛溶液后对大鼠进行麻醉，之后将其呈仰卧位姿势固定之后进行解剖处理。每组选取一定比例大鼠并直接取出心脏，进行预冷处理并清洗后冷冻保存，测定其心肌和蛋白表达情况。对另一部分大鼠心脏进行灌注固定处理，配制0.85%生理盐水，通过针头灌注，同时注入一定浓度肝素2 mL，短时间内剪断下腔静脉使血液流出，等待一段时间后，灌注4%多聚甲醛300 mL。取出心脏放置一段时间后通过磷酸缓冲盐溶液冲洗，之后进行梯度酒精脱水并包埋处理，观察Cx43蛋白表达情况。

1.3心肌Cx43 mRNA表达测定检测3组Cx43 mRNA表达情况，采用荧光定量PCR方法测定，之后提取出总RNA，之后进行荧光定量PCR。反应体系包括组分较多，主要有10×PCR缓冲液、Taq聚合酶和cDNA组成。具体反应步骤：在95 ℃环境下进行1个PCR循环，持续时间为3 min；在类似条件下进行40个PCR循环。接着通过仪器定量PCR检测。

1.4心肌Cx43蛋白表达检测取出相应心肌组织匀浆，进行离心处理后取出上清，之后煮沸并电泳处理，并加入一定量的Cx43。洗膜之后进行室温振荡孵育，显色处理。通过灰度值比值确定相应Cx43的蛋白水平。

1.5心肌Cx43免疫组织化学染色分析通过免疫组织化学SABC法确定心肌蛋白的定位表达，制定切片后进行脱蜡、漂洗处理，孵育一段时间后滴加一抗孵育，将培养液放置在室温环境下进行PBS漂洗，加入生物素化二抗之后放在温室环境下孵育，加入SABC，进行相应显色、脱水处理。

2　结　果

2.13组大鼠心肌Cx43 mRNA表达比较3组大鼠心肌组织取材提取mRNA，进行荧光定量测定发现，心肌梗死组Cx43 mRNA表达与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；多西环素组治疗后Cx43 mRNA表达提高，与心肌梗死组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1、图1。

表1　3组大鼠心肌Cx43 mRNA表达比较(±s)

注：与假手术组比较，**P<0.05。

图1心肌Cx43 mRNA表达

2.23组大鼠心肌Cx43表达量比较多西环素组表达量高于心肌梗死组(P<0.05)；但多西环素组Cx43表达量低于假手术组(P<0.05)。详见表2、图2。

表2　3组大鼠心肌Cx43表达量比较(±s)

图2心肌Cx43表达量图谱

2.3心肌Cx43免疫组织化学染色分析免疫阳性反应呈棕褐色，多西环素组心肌Cx43蛋白表达量高于心肌梗死组(P<0.05)，但低于假手术组(P<0.05)。详见图3、表3。

图3　心肌Cx43免疫组织化学染色分析图

3　讨　论

急性心肌梗死是一种常见的心脏疾病，导致心肌重构，这种重构和降解代谢失衡密切相关，且出现相应的心肌细胞电生理变化；心肌梗死的持续改变主要表现为心室重塑，包括左心室体积增大、形态改变及梗死节段心肌变薄和非梗死节段心肌增厚，这种改变对心室的收缩效应及电活动均有影响。不断肥大的心室和减慢的电传导速率与电冲动的异位起搏密切相关。

心脏缝隙连接蛋白是连接两个相邻细胞质的聚体通道，缝隙连接蛋白是小于1 kDa特殊小分子物质、代谢产物、离子的交换通道，是两个相邻心肌细胞的电偶联通道。目前发现心肌表达量较高的3种缝隙连接蛋白亚型分别是Cx40、Cx45和Cx43。哺乳动物Cx43是心室肌重要的缝隙连接蛋白；Cx43和心肌细胞之间的信息传递密切相关，且在保持心肌组织整体性和收缩性能方面有重要作用。破坏心肌细胞的联系常引起相应Cx43数量减少，在一定条件下易导致猝死；Cx43基因转基因小鼠研究发现减少心室缝隙连接的偶联易诱发室性心律失常；缝隙连接蛋白基因转基因小鼠研究证据发现减少心室缝隙连接的偶联易诱发室性心律失常。

相关研究发现，MMPs不仅在细胞基质降解过程起重要作用，且影响胶原合成的调节过程，导致相应的MMPs表达明显变化。细胞外基质的积累增多会使相应的心肌细胞间距增加，引起相应的心肌细胞失偶联。MMPs在心肌细胞基质合成过程起到一定作用，与之相关的Cx43蛋白明显影响心肌细胞的电传导过程。相关研究发现，若氧含量不足导致乳鼠心肌细胞Cx43表达量下降，在此情况下出现相应恶性心律失常，并导致Cx43表达下降[8-10]。

多西环素是一种常用的四环素类抗生素，在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中对MMP抑制方面有重要作用，其与MMP活性中心结合并抑制后者的转录过程，降低MMP表达水平，且抑制MMPs活性[11-13]。Cx43含量减少延长心肌愈合时间并导致一定程度的心律失常；MMPs降解心肌细胞基质并在一定条件下诱发心律失常；多西环素保护大鼠心肌梗死区域的缝隙连接蛋白影响左室重塑、提高心室功能，且降低梗死后对室性心律失常的易感性[14-16]。

本研究过程发现，心肌梗死后心肌Cx43蛋白表达量显著降低，多西环素治疗后可提高Cx43表达，提示多西环素治疗心肌梗死具有一定的疗效。

参考文献：

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