过表达脑红蛋白对AD转基因小鼠学习记忆能力、空间探索能力的影响及其机制

宋晓征，张雄

(1中航工业三六三医院，成都 610000；2重庆医科大学神经科学研究中心)

阿尔茨海默病(AD)是常见的神经退行性变性疾病，神经元丢失是此病的三大病理特征之一，也是导致AD患者认知功能障碍的重要原因，主要表现为神经元的凋亡[1]；半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族是一类与凋亡密切相关的特异性关键酶，其家族成员众多，而作为凋亡启动子和凋亡执行者的经典代表Caspase-9、Caspase-3，在凋亡的发生发展过程中发挥了关键作用。因此，如何抑制Caspases的活性，进而阻止神经元的凋亡，将是防治AD的关键策略[2]。过表达脑红蛋白(pNGB)是一种新型携氧球蛋白，以往多数研究集中于NGB对脑缺氧、缺氧的保护作用及机制[3,4]。我们前期体外研究已经证实，pNGB可通过抑制Caspase-3、Caspase-9表达，进而抑制Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，从而发挥神经保护作用[5]。那么在AD的体内模型中，pNGB是否也可通过抑制Caspase-3、Caspase-9表达，进而抑制神经元凋亡，从而发挥脑保护作用以往鲜有报道。因此，本研究以双转基因AD小鼠为研究对象，通过侧脑室注射pNGB，观察pNGB对AD小鼠的学习记忆能力、空间探索能力的影响，并探讨其机制是否与抑制Caspase-3、Caspase-9表达有关。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组B6C3-Tg(APPswe/PSEN1dE9)85Dbo/j品系的双转基因小鼠(Tg2576)购自南京大学模式动物研究所[动物许可证号：SCXK(苏)2010-0111]。鉴定后，取24只AD胎鼠，雌雄各半，体质量25～30 g，于实验中心SPF级室饲养，每笼4只。所有室内温度保持在(24±1)℃，鼠粮、水充足。13月龄后，随机分为实验组、模型组、对照组各8只。

1.2质粒、试剂及仪器pNGB质粒、空质粒pCDNA3.1(没有插入外源要表达或克隆的片段)均由上海吉凯公司提供。Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒、蛋白提取试剂盒、浓度检测试剂盒、SDS-Page胶配置试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；兔抗人多克隆抗体Caspase-3、Caspase-9购自Bioworld公司；内参兔抗β-actin和HRP标记的山羊抗兔二抗购自博鳌森生物技术有限公司；PVDF膜和ECL发光试剂盒购自Bio-rad公司。脑立体定位仪、水迷宫视频分析系统、Bio-rad凝胶电泳系统、Bio-rad凝胶成像系统。

1.3 pNGB注射方法将AD小鼠置于立体定位仪上固定双耳，消毒后剪开头部皮肤，实验组、模型组、对照组分别于右侧侧脑室(前囟后2 mm，旁开1.5 mm，深度2 mm)注射pCDNA3.1(1 μg/μL)+pNGB(1 μg/μL)、生理盐水+pCDNA3.1(1 μg/μL)、生理盐水，注射体积均为5 μL[6]，每周1次，连续8周[7]。

1.4大鼠学习记忆能力和空间探索能力评价采用Morris水迷宫实验评价小鼠学习记忆能力和空间探索能力。①定位航行实验：实验第1 d天，将平台(插小红旗)放置于第三象限，高出水面约1 cm。将小鼠随机放入某一象限，并开始计时，记录小鼠自己寻找平台的时间(逃避潜伏期)。若小鼠在1 min内找到并爬上平台，则记录具体时间；若小鼠在1 min后仍未找到平台，则将小鼠引导至平台附近使之爬上平台并停留10 s。按上述方法对每只小鼠每天训练5次，分别从不同的象限放入水中，并且每一轮的训练至少间隔1 h。在实验第2～5 d，使平台低于水面约1 cm，按照第1 d的象限顺序放入小鼠，记录每次找到平台的时间，计算平均成绩，以平均成绩作为评价小鼠学习记忆能力的指标。②空间探索实验：实验第6 d，撤掉平台，小鼠从第三象限放入，使之在池内游泳5 min，记录小鼠游泳轨迹，观察并记录其穿过第三象限的时间、次数及游泳时间，计算平均成绩，以平均成绩作为评价小鼠空间探索能力的指标。

1.5脑组织Caspase-3、Caspase-9酶活性检测PBS灌注后处死小鼠，迅速取脑，加入蛋白裂解液，小心研磨，离心后取上清液，并保存。根据试剂盒说明进行实验，将上清液移到预冷的EP管中，立即测定Caspase-3、Caspase-9酶活性。根据Caspase-3酶活性变化释放的pNA与Caspase-3的活性呈正比，将pNA释放的405 nm的波长OD值作为Caspase-3、Caspase-9酶活性值。

1.6脑组织Caspase-3、Caspase-9蛋白检测采取Western blotting法检测。称取脑组织，迅速加入蛋白裂解液，小心研磨，离心后取上清液。测定总蛋白浓度。上样40 μg的总蛋白，进行SDS-PAGE胶(8%～10%)电泳，然后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，PVDF膜浸泡在含有抗体Caspase-3(1∶200)、Caspase-9(1∶200)和β-actin(1∶5 000)的TBST液中，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后，加入兔抗HRP(1∶5 000)，室温下孵育1～2 h，ECL发光，凝胶成像系统分析各目的蛋白光密度灰度值和内参β-actin灰度值的比值。每次实验重复3次，取平均值。

2　结果

2.1实验第1～5天各组小鼠逃避潜伏期比较结果见表1。

表1　实验第1～5天各组小鼠逃避潜伏期比较

注：与模型组、对照组比较，*P<0.05。

2.2实验第6天各组小鼠穿越次数、穿越距离、穿越时间比较结果见表2。

表2　　　　实验第6天各组小鼠穿越次数、穿越距离、穿越时间比较

注：与模型组、对照组比较，*P<0.05。

2.3各组小鼠脑组织Caspase-3、Caspase-9酶活性比较结果见表3。

表3　　　　各组小鼠脑组织Caspase-3、Caspase-9酶活性比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4各组小鼠脑组织Caspase-3、Caspase-9蛋白表达比较结果见表4。

表4　　　　各组小鼠脑组织Caspase-3、Caspase-9蛋白表达比较

注：与模型组、对照组比较，*P<0.05。

3　讨论

AD是一种起病隐匿的中枢神经系统退行性变性疾病，主要表现为进行性的全面认知功能障碍。随着世界人口的老龄化变化，AD的发病率也不断增高，已然成为一类严重威胁人类健康的疾病。众所周知，AD的三大病理特征包括Abeta沉积形成老年斑、Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结和神经元的丢失(凋亡)，而后者与AD典型临床表现(认知和记忆功能障碍)的关系最为密切，因此如何抑制神经元的凋亡可能成为改善认知功能，进而防治AD的重要策略之一。

pNGB是一种在神经元内有丰富表达的新型携氧球蛋白，它在一些内分泌细胞和视杆细胞中也有少量表达。在人体内，pNGB含量会随着年龄的逐渐增加而呈递减趋势。Sun等[8]在对AD患者进行尸检的研究中发现，在AD早期，脑内pNGB是增加的，在进展期则更为明显，而到严重AD时，pNGB水平则降低到正常水平以下，这提示pNGB在脑内存在一个动态变化的过程。本实验中，我们选择13月龄大小的AD小鼠，因为这个阶段的AD小鼠认知功能受损严重，其脑内pNGB明显低于正常水平，因此符合我们的实验需要。

Caspase-3和Caspase-9是Caspases家族中最为重要的两个成员，一个是凋亡的启动子，另一个是凋亡的执行者，两者关系还十分密切，Caspase-9能激活Caspase-3，活化的Caspase-3能特异性地切割DNA，进而使参与DNA损伤修复过程的聚ADP核糖聚合酶以及DNA依赖的蛋白激酶等失活，促使染色质凝聚和核酶激活，最终导致细胞凋亡。Caspase-3还可以反过来可激活Caspase-9，形成正反馈。因此，Caspase-3、Caspase-9活性高低可以反映凋亡程度，抑制其活性，进而抑制凋亡导致的损伤[9]。研究[10]表明，在AD中Caspase的激活与AD的病理特征密切相关，在Aβ处理的PC12细胞以及Abeta注射的小鼠海马组织内可以检测到Caspase-3、9、12等水平增加；Caspase-9可与Abeta结合，抑制细胞内凋亡体的形成，进而抑制细胞的凋亡[11]；APP存在着3个Caspase剪切位点，即(P4)DNVD 197(P1)/S、(P4)DYAD219(P1)/G、(P4)VEVD720(P1)/A[12]，这些都提示抑制Caspase活性可降低Aβ诱导的细胞凋亡，从而对AD患者脑组织起保护作用[13]。我们前期体外实验通过水溶性Aβ1-42处理SH-SY5Y建立了AD的细胞模型，并转染pNGB，发现过表达的NGB不仅能够促进细胞的生长，而且还能够保护细胞的膜电位，抑制细胞的凋亡；进一步研究发现，NGB可以抑制细胞内Caspase-3、9表达，从而发挥神经保护作用，这说明pNGB可以通过抑制神经细胞的凋亡而发挥细胞的保护作用，这跟国外的报道[14]显示pNBG具有抗凋亡作用的结果一致，但这些实验多以细胞为研究对象。本实验中我们以转基因AD小鼠为研究对象，结果显示实验组第5天逃避潜伏期较模型组、对照组短，实验第6天穿越次数较模型组、对照组多，穿越距离、穿越时间较模型组、对照组长，脑组织Caspase-3、Caspase-9酶活性和蛋白表达较对照组降低。

总之，pNGB改善了转基因AD小鼠学习记忆能力和空间探索能力，这种神经保护作用与其能够抑制Caspase-3、Caspase-9活性和蛋白表达，进而抑制神经元凋亡、保护神经元密切相关，这为pNGB防治AD提供了理论依据，但其具体的机制需深入的研究。

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