早期胆汁外引流对重症急性胰腺炎大鼠血清高迁移率族蛋白B1和血红素加氧酶1表达的影响*

张赛，王付海，温庆彬，赵玉成，吴志正，田虎

（1.山东中医药大学 第二临床学院，山东 济南 250000；2.山东省千佛山医院 普外中心，山东 济南 250000）

随着生活水平的提高，胰腺炎发生率也在明显提高，追求更多减缓胰腺炎炎症的进程和促进机体机能快速恢复的方法成为了当前的研究焦点。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein, HMGB1）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）是SAP发生发展过程中重要的炎性因子，同时血红素加氧酶1（heme oxygenase 1, HO-1）可抑制炎症反应。本实验通过建立SAP大鼠模型，探讨早期胆汁外引流对SAP大鼠炎性因子HMGB1和TNF-α以及抑制炎性因子HO-1表达的影响，从而达到调控炎症，保护相关脏器的作用，进而指导临床应用。

1 材料与方法

1.1 材料

54只健康清洁Wistar成年大鼠，雌性，体重190～200 g，由山东省朋悦公司提供；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司提供）；牛磺胆酸钠（美国Sigma公司提供）。

1.2 仪器与设备

酶标仪（山东省千佛山医院中心实验室提供）；低速离心机（山东大学弘立医学动物实验公司提 供）。

1.3 试验方法

1.3.1 实验过程一 将54只健康清洁Wistar成年大鼠分成3组，每组大鼠各18只，假手术组（SOG组)、模型未引流组（SAP组)和模型引流组（BDG组）。构建大鼠SAP模型：采取腹腔注射麻醉，取上腹部正中开腹，沿肝十二指肠韧带找到胆总管后，暂时夹闭肝门部胆管，使用0.45号头皮针头于十二指肠外侧壁（对系膜缘）穿孔，经胰胆管逆行注射4%牛磺胆酸钠（0.1 ml/100 g），逐层关腹，术后大鼠继续禁食，自由饮水。SAP组与BDG组均构建大鼠SAP模型，BDG组大鼠行早期胆汁外引流处理；SOG组只行开腹手术。

1.3.1 实验过程二 实验结束后立即行开腹手术，在无菌条件下抽取下腔静脉血液3～4 ml，室温放置2 h后，1 000 g离心20 min，取上清；应用ELISA法检测细胞因子TNF-α、HO-1以及HMGB1的表达和含量：取出ELISA试剂盒板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔加不同浓度标准品50 μl（TNF-α标准品浓度依次是240、160、80、40、20和0 pg/ml；HO-1标准品浓度依次是1 800、1 200、600、300、150 和 0 pg/ml；HMGB1标准品浓度依次是：12、8、4、2、1和0 μg/L），样本孔加入待测样本50 μl，空白孔不加；除空白孔外，标准品孔与样本孔每孔加入辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase, HRP）标记的检测抗体100 μl，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60 min；弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液350 μl，静置1 min；甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；洗板完成后，每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μl，15 min内，在450 nm波长处测定各孔吸光度（optical density, OD）值，以标准品浓度与其OD值绘出标准曲线，计算样品实际浓度。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组计量资料组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），其中组间两两数据比较采用Dunnet-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组研究对象TNF-α水平比较

建模成功后第3、6和12小时SAP组TNF-α水平均显著高于SOG组（P＜0.05） ；建模成功后第3、6和12小时，SAP组与BDG组TNF-α水平比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 3组研究对象HMGB1水平比较

建模成功后第3、6和12小时，SAP组与SOG组HMGB1水平比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；建模成功后第3和12小时，SAP组与BDG组HMGB1水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；建模成功后第6小时，SAP组与BDG组HMGB1水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 3组研究对象HO-1水平比较

建模成功后第3、6和12小时BDG组HO-1水平均显著高于SAP组（P＜0.05）；建模成功后第3、6和12小时，SAP组与SOG组HO-1水平比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表1 3组研究对象建模成功后不同时间点TNF-α水平比较 （±s, pg/ml）

表1 3组研究对象建模成功后不同时间点TNF-α水平比较 （±s, pg/ml）

注：1）与SOG组比较，t =40.195，29.193，40.202；P =0.000，0.000，0.000。2）与SAP组比较，t =7.061，7.310，8.539；P =0.000，0.000，0.000。

组别 例数 3 h 6 h 12 h SOG 组 6 86.83±1.29 106.91±3.44 103.69±1.11 SAP 组 6 216.31±8.461） 267.57±13.061） 215.95±6.751）BDG组 6 189.59±5.472） 226.77±4.392） 187.87±4.392）

表2 3组研究对象建模成功后不同时间点HMGB1水平比较 （±s, pg/ml）

表2 3组研究对象建模成功后不同时间点HMGB1水平比较 （±s, pg/ml）

注：1）与SOG组比较，t =14.203，13.014，8.520；P =0.000，0.000，0.000。2）与SAP组比较，t =0.172，11.669，0.549；P =0.867，0.000，0.595。

组别 例数 3 h 6 h 12 h SOG组 6 9.90±0.0.76 9.45±0.81 9.62±0.0.36 SAP 组 6 15.81±0.661） 17.5±0.411） 15.85±0.751）BDG组 6 15.75±0.572） 14.31±0.522） 15.64±0.0.682）

表3 3组研究对象建模成功后不同时间点HO-1水平比较 （±s, pg/ml）

表3 3组研究对象建模成功后不同时间点HO-1水平比较 （±s, pg/ml）

注：1）与SOG组比较，t =9.247，11.884，21.355；P =0.000，0.000，0.000。2）与SAP组比较，t =4.847，14.738，32.106；P =0.002，0.000，0.000。

组别 例数 3 h 6 h 12 h SOG 组 6 2 061.13±67.61 2 074.95±19.33 1 945.52±20.89 SAP 组 6 2 376.99±95.021） 2 232.38±66.851） 1 689.19±20.691）BDG组 6 2 588.84±49.282） 2 664.09±26.052） 2 303.44±42.042）

3 讨论

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是由多种原因促使胰酶异常激活的胰腺急性进程的炎症疾病,其中胆源性和酒精所致的急性胰腺炎在临床中比较常见[1]。急性重症胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）的特点是胰腺组织坏死感染合并持续性的器官衰竭，而SAP全身炎性反应是其全身性炎性病变的基础[2]。HMGB1是一种新型的炎性细胞因子，既往研究已经证实HMGB1与SAP的发生与严重程度相关[3]。本研究结果显示，建模成功后第3、6和12小时，SAP组HMGB1水平均高于SOG组（P＜0.05），本结果也证实了上述观点。晚期糖基化终产物受体（receptor of advanced glycation end products, RAGE）是HMGB1的主要受体，RAGE与HMGB1具有高度亲和力[4]，两者结合后可同时激活两条下游信号途径：一条是Ras和NF-κB途径，其涉及炎症和应激反应；另一条Rac和cdc42途径，其与细胞的运动性和神经轴突生长有关[5]。Park等[6]证实HMGB1可与膜受体结合激活Toll样受体介导的炎症通路，使下游NF-κB表达增加，引起瀑式炎症反应，并且HMGB1参与脓毒症的致死效应，且该细胞因子出现较晚且持续时间更长[7]。TNF-α是一种由巨噬细胞分泌的细胞因子,其被证实在SAP发病机制中起重要作用，其可使NF-κB活化，进一步引起一系列炎症反应[8-10]。本研究显示，建模成功后第3、6和12小时SAP组TNF-α水平均显著高于SOG组（P＜0.05），以上证实了TNF-a与SAP的严重程度有关。HO-1是HO的亚型，其作为一种热休克蛋白-32，可通过抵抗细胞的凋亡和氧化从而改善机体微循环[11-12]。HO-1可催化血红素，使血红素正中位α碳链断裂,产生等摩尔的胆绿素、亚铁离子（Fe2+）和一氧化碳（CO），这3种代谢产物都具有抗氧化，减缓组织损伤的功能，当机体受到细胞因子、一氧化氮（NO）以及低氧等刺激产生氧化应激反应时，HO-1表达升高，一定程度上是通过血红素代谢产物从而发挥抗炎作用[13]。本实验结果显示，建模成功后第3、6和12小时BDG组HO-1水平均显著高于SAP组（P＜0.05）；而SAP组HO-1水平随时间的延续呈下降趋势。以上结果提示SAP组炎症程度呈增高趋势，并且HO-1表达的增加可抑制SAP的炎症反应。

当前对重症急性胰腺炎的研究主要集中于液体复苏和抑制胰液中胰酶释放等应用方面，对于早期胆汁外引流延缓SAP的进程尚缺乏理论依据。临床中，以内镜鼻胆管引流（endoscopic nasobiliary drainage, ENBD）、内镜胆管支架内引流（endoscopic retrograde biliary drainage, ERBD）为主的胆汁外引流治疗方式，具有操作简单、创伤小、效果明显、并发症少且费用低等优点[14]。有研究证实，SAP患者行胆汁引流术后，相关炎症因子淀粉酶等胰腺炎指标及相关炎症因子表达水平明显降低。Liu等[15]研究证实失血性休克大鼠和内毒素休克大鼠行“胆汁外引流”后，大鼠的存活时间均显著延长，同时其肠道的病理损伤显著减轻。相关文献报道，休克以及脓毒血症患者或动物模型胆汁中含有多种炎性细胞，如TNF-α、HMGB1以及NF-κB等炎性因子，当胆汁引流使炎性细胞流出体外，并使炎性细胞含量降低，从而缓解患者或实验动物的炎症状况[16-18]。本实验通过建立SAP大鼠模型，行早期胆汁外引流，第3、6和12小时BDG组HMGB1、TNF-a水平均低于SAP组（P ＜0.05），证实了早期胆汁外引流确实可以减少SAP大鼠血清中炎性因子的表达，调控炎症反应，进而减缓SAP的进程，起到保护相关脏器的作用。

综上所述，早期胆汁外引流可调控SAP患者炎症反应，为ENBD和ENRD在SAP患者的临床应用中提供了一定的理论依据，也为临床中寻求更多减缓胰腺炎炎症进程和促进机体机能快速恢复方法做出了贡献。

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