优化的日本血吸虫Sj16AA蛋白的原核表达*

黄叶红，阳敏，彭博，李俊辉，刘洪，庄权，吴翔，舒衡平，明英姿

（1.中南大学湘雅医学院 寄生虫教研室，湖南 长沙 410078；2.中南大学湘雅三医院器官移植中心，湖南 长沙 410013）

蠕虫作为一类古老的寄生虫，在漫长的进化过程中，获得了独特的免疫调节能力，能够逃逸宿主的免疫反应，与宿主形成了一种“共生”状态[1-3]。日本血吸虫（Schistosoma japonicum）是蠕虫的一种，广泛分布于我国长江流域。大量研究表明，血吸虫可溶性虫卵蛋白（soluble egg antigen, SEA）具有较好的免疫调节作用。1996年，Ramaswamy等[4]首先从曼氏血吸虫分泌物中分离出一种蛋白质，分子量约为16 kDa，命名为Sm16。进一步研究发现，Sm16能抑制抗原诱导的淋巴细胞增生和白介素-2（interleukin-2, IL-2）生成，从而抑制宿主的免疫反应。2009年，吴忠道等[5]首次从日本血吸虫中获得了类似的蛋白成分，命名为Sj16蛋白。经检测，Sj16核苷酸序列与Sm16有99%的相似度，蛋白序列相似度达到100%。后续研究发现，Sj16对不同抗原诱发的适应性免疫具有明显的下调作用，其表现为减少相应抗体的产生和IL-12的合成，抑制Th1的反应和MHC II的表达[6]。Sj16蛋白存在一个功能性的核苷酸N端，可以抑制LPS诱导的树突状细胞（dendritic cells, DCs）的成熟，并促进DCs IL-10的释放[7]。rSj16通过抑制PPRA-α信号通路对葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎具有保护作用，这为治疗炎症性肠病提供一种新方案[8]。这说明Sj16蛋白同样具有免疫调节的功能。

Sj16的免疫调节功能在器官移植免疫中的作用令人期待。然而，我们在合成Sj16蛋白时发现，其可溶性并不理想，严重影响了Sj16在体内的吸收和功能。Martin Gullberg等通过对Sm16蛋白结构的深入研究，发现其氨基酸序列中第92位的异亮氨酸（Ile-92）和第93位的亮氨酸（Leu-93）是影响其可溶性的重要位点；将它们进行突变后，可溶性大大增加[9]。因此，在本实验中，我们对Sj16蛋白序列进行了优化，以增强Sj16AA的表达，提高其可溶性，为进一步应用于器官移植免疫研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌种 PUC-sp质粒（上海生工）、pMal-c2X质 粒（New England Biolabs, NEB）、BL21/DE3菌为本室保存的。

1.1.2 主要试剂 Quick-Fusion无缝克隆试剂盒（Biotool），EcoR I、Sal I限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA marker和逆转录酶（为上海拜朗生物公司产品）、Taq DNA聚合酶、dNTP（TaKaRa）、辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG（Proteintech）；抗MBP抗体（Proteintech）；氨苄青霉素（北京鼎国昌盛生物科技有限公司）、IPTG（BioFroxx）、PCR产物胶纯化回收试剂盒和质粒小提试剂盒（OMEGA）。

1.2 方法

1.2.1 Sj16AADNA模板的设计和合成 在Sj16 DNA序列的基础上[5]，将Ile-92、Leu-93的密码子序列更改为丙氨酸（Ala）密码子GCG，并针对大肠杆菌表达系统进行密码子优化。同时，在上游引入EcoR I酶切位点GAATTC，下游引入Sal I酶切位点GTCGAC。所得DNA序列由上海生工公司在PUC-sp质粒中合成。全长序列：GAATTCA TGAAAGTTACCCCGATCATCTTCGCGGTTTTCTGC GTTGTTGGCGCGATGACCCTGATCACCGCGACGA CCCTGGAACAGGCGCCGCACCCGAGCGAAAAAG ACATGGAACTGGTGTACATCGACGCGGAATACGA AAAAGAAGGCGGCCTGAAGAGCATCTGCAACGAA ATCAAAAGAAGCTTCCGTAAAGGCCGTCACCACA TCTACAAAGTTATGGATAAATACATCCGCAAAGA AGACCTGGGCATGAAAATGCTGGACGTGGCGAAA GCGGCGGGCCGTCGTATCGAAAAACGTATGGAAT ACATCGCGAAAAAACTGGACAAAATGATGGAATA CGAAAGCAGCGTCGAC。

1.2.2 PCR引物的设计 根据Quick-Fusion无缝克隆试剂盒的要求及表达载体pMal-c2X的图谱，采用Primer Premier 5.0软件分析基因序列，设计特异性引物。基因引物设计如下：正义引物：GA GGGAAGGATTTCAGAATTCATGAAAGTTACC，反义引物：CAAGCTTGCCTGCAGGTCGACGCTGCTTT CGTA

1.2.3 Sj16AA基因的PCR扩增及Sj16AA基因原核表达重组质粒的构建和鉴定 以构建到PUC-sp载体上的日本血吸虫蛋白Sj16AA全长基因为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件 ：94℃，5 min ；（98℃，10秒，55℃，5秒，72℃，20秒）循环30次；72℃，7 min；4℃，终止。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳回收目的片段。

将pMal-c2X载体通过限制性内切酶EocR I和Sal I酶切后得到线性化载体，采取Quick-Fusion无缝克隆试剂盒在37℃融合30 min实现载体和PCR产物的融合，获得Sj16AA基因原核表达重组质粒pMal-c2X-Sjl6AA，并转化感受态的E.coli DH-5α。再进行涂板，挑单克隆菌液进行PCR验证；PCR阳性克隆行基因测序验证。

1.2.4 重组的Sj16AA基因在大肠杆菌中的表达和鉴 定 取70 μl阳性克隆验证中呈阳性的菌液加入到含有0.1%氨苄抗性的7 ml LB液体培养液中（1∶100接种），用50 ml离心管37℃，200 rpm振荡培养4 h，在不同浓度的IPTG（0 mmol/ L，0.1 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L） 和 不 同 温度（37℃、32℃、28℃、16℃）下，200 rpm诱导10～13 h。将上述菌液6 000 rpm，4℃，离心10 min，弃上清。每管菌加400 μl PBS（pH 7.3）重悬，按1∶100的比例加入PMSF（100 mmol/L），涡旋振荡混匀，100℃煮沸10 min。沉淀用120 μl 8 mol/L尿素溶解，加入40 μl 4×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）混合。SDS-PAGE检验蛋白表达情况。条件：130 V，90 min跑胶。卸胶后用考马斯亮蓝染色液染色4～5 h，过夜脱色，之后每隔一段时间更换脱色液，直至背景色脱干净。

1.2.5 Western-blot鉴定 将凝胶置BIO-RAD转移电泳装置进行，300 mA，4℃下转膜1 h。丽春红染膜后观察结果，洗膜后用5%脱脂奶粉PBST封闭1 h。将抗MBP抗体以1∶1 000稀释，过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG 1∶1 000稀释，底物显色系统为DAB-H202。

2 结果

2.1 PCR获得日本血吸虫蛋白Sj16AA基因

以构建到PUC-sp质粒上的日本血吸虫蛋白Sj16AA全长基因为模板，用设计的基因特异性引物进行PCR结果如下（见图1），全长基因大约为363 bp，初步证明目的片段已被正确扩增。

图1 Sj16基因的PCR扩增结果

2.2 Sj16AA蛋白最佳表达条件的确定

2.2.1 诱导温度对融合蛋白表达的影响 与诱导温度28℃、30℃、32℃或37℃相比，16℃诱导时可溶性MBP-Sj16（58 kDa）的表达比例明显升高 ；当温度高于16℃时，随着温度的升高，MBPSj16可溶性下降，主要以包涵体形式存在（见图2）。因此，本研究将16℃作为优化后的诱导温度。

图2 不同温度诱导条件下SDS-PAGE电泳检测结果

2.2.2 诱导剂浓度对MBP-Sj16表达的影响 诱导剂浓度影响融合蛋白的表达，为了探究最佳诱导剂浓度，本研究设置了不同的诱导剂IPTG浓度梯度 ：0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/ L。比较不同诱导剂浓度下的可溶性蛋白表达情况，发现IPTG为0.5 mmol/L时可溶性蛋白比例明显高于其他组别（见图3）。

图3 不同诱导剂浓度条件下SDS-PAGE电泳检测结果

2.3 Western-blot验证Sj16AA蛋白的表达

在可溶性MBP-Sj16的优化后的表达条件下，扩大摇菌体积为1.5 L，当OD值为0.6时，进行诱导表达，IPTG浓度为0.5 mmol/L，16℃温度下诱导表达13 h。收集菌体后超声破碎细菌，收集上清进行融合蛋白验证和纯化。pMal-c2X转化菌经诱导后出现一分子量约为42 kDa明显表达带，此为MBP蛋白；pMal-c2X转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导后，较诱导前于约58 kDa出现一条明显的融合蛋白表达条带（见图4）。免疫印迹分析，pMal-c2X转化菌经诱导于约58 kDa处有一条带为pMal-c2X转化菌经诱导表达MBP-Sj16蛋白能特异地被抗MBP抗体识别（见图5）。

图4 融合蛋白纯化后SDS-PAGE电泳检测结果

图5 MBP-Sj16的Western Blot验证

3 讨论

血吸虫病是热带和亚热带地区主要的寄生虫病之一，目前全球大约有2亿人感染，每年死亡人数超过28万，由于血吸虫能够在宿主血管内生活数十年，其能够逃逸宿主的免疫反应。因此，血吸虫病已成为寄生虫乃至免疫学领域的研究热点[1]。在我国血吸虫流行的是日本血吸虫，大量研究表明血吸虫的确具有免疫调节的功能[6,9-10]。2009年，南京医科大学汪雪峰等发现日本血吸虫虫卵和成虫中提取的热休克蛋白60相关的蛋白SJMHE1可诱导CD4+CD25+Treg细胞的产生，输注这类Treg可有效缓解小鼠迟发型超敏反应和胶原诱导的关节炎[11]。2013年，季旻珺等发现日本血吸虫可溶性虫卵蛋白（soluble egg antigen, SEA）可以与抗原递呈细胞，尤其是树突状细胞（dendritic cells, DCs）表面的Toll样受体2（toll like receptor 2,TLR2）结合，从而诱导程序性坏死配体（programmed death ligand 1, PD-L1）和PD-L2的表达增加，致使表达程序性坏死因子（programmed death, PD）的CD4+T细胞死亡，从而起到免疫抑制作用[12]。最近，吴忠道等发现日本血吸虫SEA诱导DCs产生的外泌体中携带的抗炎信号可有效地缓解硫酸葡聚糖钠诱导的结肠炎的炎症反应[13]。如前所述，日本血吸虫SEA可以有效诱导免疫抑制或耐受，但SEA是一个由多种抗原组成的复合物，其作用靶点与机制可能并不单一，会给研究带来困扰，阻碍其在临床上的推广。

为了解决这一问题，大量研究致力于寻找一种单一的日本血吸虫虫卵蛋白来替代SEA。1996年，研究发现从曼氏血吸虫尾蚴的分泌物中提取出一种16 kDa蛋白，命名为Sm16，后续的体外功能实验中发现，Sm16不仅能够下调角质细胞中白介素1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist, IL-1ra）的表达，而且能抑制内皮细胞中淋巴细胞增生和细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）的表达[4]。2009年，Gobert等发现Sj16的mRNA主要存在于尾蚴和童虫。同年，来自香港中文大学和中山大学的科学家们从日本血吸虫尾蚴中提取总RNA，并逆转录获得cDNA，基于Sm16的核苷酸序列设计了Sj16的引物，最终扩增最先合成了Sj16蛋白，经检测，克隆得到的Sj16核苷酸序列与Sm16有99%的相似度，蛋白序列相似度达到100%[5]。进一步研究发现重组的日本血吸虫Sj16蛋白具有较好的免疫调节功能，其存在一个功能性的核苷酸N端，其可抑制不同抗原诱发的适应性免疫，阻碍LPS诱导的DCs的成熟过程，并促进DCs IL-10的释放，通过抑制PPRA-α信号通路减轻肠道炎症反 应[6-8]。

Ramaswamy等[14]最先在大肠杆菌和杆状病毒体系中表达蛋白Sm16，尽管可以间接验证表达成功，但无法得到足够纯化的和可溶的重组Sm16蛋白。在1999年，Valle等[15]在细菌、酵母和昆虫体系中尝试表达SmSLP（stathmin-like protein），其产量都非常低。这些研究表明原核或真核表达体系来表达出高产量和可溶性高的Sm16蛋白是非常困难的。2009年，为合成可溶性高和纯化的Sm16蛋白，Martin Gullberg等对其Sm16氨基酸序列修饰及密码子优化，降低肽链的聚合性，减少疏水性，从而促进其表达和纯化，并具有较好的可溶性；同时，优化的蛋白，其免疫调节功能并未受影响[9]。笔者尝试借鉴他们的方法对Sj16氨基酸序列进行改造，在设计新的Sj16蛋白的核苷酸序列时，将第92位的异亮氨酸（Ile-92）和第93位的亮氨酸（Leu-93）对应的密码子更换为丙氨酸（Ala）的密码子，通过减少肽链的聚集性，降低其疏水性，增加Sj16AA蛋白的可溶性。此外，由于Sj16核苷酸序列中含有部分密码子对大肠杆菌来说属于稀有密码子，笔者对其进行了优化，以提高Sj16AA蛋白的表达。

在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。因此，应设法使目的蛋白以可溶形式表达的越多越好，即增强蛋白的可溶性表达，通常的策略有降低蛋白合成的速度、改变培养基、与分子伴侣或折叠酶共表达及使用特定的菌株等。本实验以低温低IPTG长时间诱导的方法（16℃，0.5 mmol/L IPTG诱导10～13 h），成功避免了包涵体形成，获得了足够量的可溶性蛋白。同时，采用了pMal-c2X质粒，该质粒在编码蛋白的N端带有MBP融合标签，可以用抗MBP抗体来检测蛋白的表达情况。并引入了切除MBP的蛋白酶切位点，方便后续实验中切除MBP。

通过笔者课题组的努力，成功地克隆了原核表达重组质粒pMal-c2X-Sj16AA并进行了原核表达，获得了较纯化的且可溶性较高的Sj16蛋白，已将其应用于动物实验，取得了较理想的效果，经优化的Sj16蛋白可以更好地应用于移植免疫相关的临床与基础实验。

[1]Finlay CM, Walsh KP. Mills KHG. Induction of regulatory cells by helminth parasites： exploitation for the treatment of inflammatory diseases[J]. Immunological Reviews, 2014, 259(1)： 206-230.

[2]McSorley HJ, Maizels RM. Helminth infections and host immune regulation[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2012, 25(4)： 585-608.

[3]Curwen RS, Ashton PD, Sundaralingam S, et al. Identification of novel proteases and immunomodulators in the secretions of schistosome cercariae that facilitate host entry[J]. Molecular &Cellular Proteomics MCP, 2006, 5(5)： 835-844.

[4]Ramaswamy K, Salafsky B, Potluri S, et al. Secretion of an antiinflammatory, immunomodulatory factor by Schistosomulae of Schistosoma mansoni[J]. Journal Inflammation, 1995, 46(1)： 13-22.

[5]Hu S, Wu Z, Yang L, et al. Molecular cloning and expression of a functional anti-inflammatory protein, Sj16, of Schistosoma japonicum[J]. International Journal for Parasitology, 2009, 39(2)：191-200.

[6]Hu S, Yang L, Wu Z, et al. Suppression of adaptive immunity to heterologous antigens by Sj16 of Schistosoma japonicum[J]. Journal of Parasitology, 2012, 98(2)： 274-283.

[7]Sun X, Yang F, Shen J, et al. Recombinant Sj16 from Schistosoma japonicum contains a functional N-terminal nuclear localization signal necessary for nuclear translocation in dendritic cells and interleukin-10 production[J]. Parasitology Research, 2016, 115(12)：1-13.

[8]Wang L, Xie H, Xu L, et al. rSj16 protects against DSS-induced colitis by inhibiting the PPAR-α signaling pathway[J].Theranostics, 2017, 7(14)： 3446-3460.

[9]Brannstrom K, Sellin ME, Holmfeldt P, et al. The Schistosoma mansoni protein Sm16/SmSLP/SmSPO-1 assembles into a ninesubunit oligomer with potential to inhibit Toll-like receptor signaling[J]. Infection and Immunity, 2009, 77(3)： 1144-1154.

[10]Hu Y, Sun L, Yuan Z, et al. High throughput data analyses of the immune characteristics of microtus fortis infected with Schistosoma japonicum[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1)： 11311.

[11]Wang X, Zhou S, Chi Y, et al. CD4+CD25+ Treg induction by an HSP60-derived peptide SJMHE1 from Schistosoma japonicum is TLR2 dependent[J]. European Journal of Immunology, 2009,39(11)： 3052-3065.

[12]Gao Y, Chen L, Hou M, et al. TLR2 directing PD-L2 expression inhibit T cells response in Schistosoma japonicum infection[J]. PloS One, 2013, 8(12)： e82480.

[13]Wang L, Yu Z, Wan S, et al. Exosomes derived from dendritic cells treated with Schistosoma japonicum soluble egg antigen attenuate DSS-induced colitis[J]. Frontiers in Pharmacology, 2017, 8：651.

[14]Rao KY, Ramaswamy K. Cloning and expression of a gene encoding Sm16, an anti-inflammatory protein from Schistosoma mansoni[J].Molecular and Biochemical Parasitology, 2000, 108(1)： 101-108.

[15]Valle C, Festucci A, Calogero A, et al. Stage-specific expression of a Schistosoma mansoni polypeptide similar to the vertebrate regulatory protein stathmin[J]. Journal of Biological Chemistry,1999, 274(48)： 33869-33874.