奥美拉唑诱导非小细胞肺癌细胞对新型分子靶向药物仑伐替尼的耐受

王琳琳，姜棋予，秦萌萌，马壮

1.北部战区总医院 呼吸与重症医学科，辽宁 沈阳110016；2.解放军总医院 第五医学中心临床研究管理中心，北京100039

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺部肿瘤最主要的病理类型，受限于现有临床诊疗策略，大部分NSCLC 患者初诊即为进展期，失去了接受外科手术切除等根治性治疗的机会[1]。目前，分子靶向药物在进展期NSCLC 治疗中具有重要意义[2]。近年来，作用于血管内皮生长因子受体（VEGFR）等靶标的分子靶向药物获批上市，进入NSCLC 的临床诊疗[3]。这些药物不仅为患者提供了更多选择，也拓展了对NSCLC分子靶向治疗的认识。尽管研究取得了诸多进展，但分子靶向治疗仍存在治疗费用昂贵、易于出现药物耐受等问题。因此，阐明分子靶向治疗耐受的分子机制，探索新的药物增敏干预靶标具有重要意义。为深入研究新型分子靶向药物对NSCLC 的杀伤作用，我们选取了最近获准上市的新型多靶标蛋白激酶抑制剂仑伐替尼（乐伐替尼，lenvatinib）进行实验。

芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一种转录因子，其结构特征为螺旋-回环-螺旋以及PAS 结构域[4]。以往研究认为AhR 对机体有保护作用，能够识别具有多环-稠环结构特征的芳香烃等化合物或环境污染物。这些化合物种类多样，包括平面芳香族（芳基）烃类、2，3，7，8-四氯二苯并二噁英以及多氯化联苯等[5]。当人体通过皮肤接触或饮食、空气污染等摄入这些物质时，AhR 就能够被识别与活化，开启下游基因的转录。近年的研究显示，AhR 是药物耐受的新型调控因子，通过介导下游基因的表达发挥药物耐受的作用[6]。AhR 能够介导细胞色素氧化酶P450家族CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1 亚型，人乙醛脱氢酶3 家族成员A1（ALDH3A1），UDP-葡糖醛酸基转移酶1A2 亚型（UGT1A2），谷胱甘肽S-转移酶A1（GSTA1）等基因表达，这些基因产物能够作为Ⅰ相或Ⅱ相药物代谢酶降解与清除抗肿瘤药物，最终导致肿瘤细胞耐药[7]。AhR 在肺癌组织、细胞中表达较高[8]，但其在肺癌发生与进展中作用的报道较少，具体调控机制也不完全清楚。

为确定AhR 对NSCLC 细胞抗肿瘤药物耐受的影响，我们用公认的AhR 激动剂胃黏膜保护药物/胃肠溃疡治疗药物奥美拉唑处理最常用和公认的NSCLC 细胞模型A549（腺癌亚型NSCLC）和H460（大细胞肺癌亚型NSCLC），在此基础上检测了奥美拉唑对AhR 活性的影响以及对仑伐替尼杀伤NSCLC 细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

免疫缺陷小鼠（BALB/c 品系的胸腺缺失小鼠，T 细胞缺失的免疫缺陷小鼠）购自北京市斯贝福生物科技有限公司；非小细胞肺癌A549、H460细胞为本实验室保存，用含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen 公司产品）的DMEM 培养液（Invitrogen公司产品）培养；细胞培养板、细胞培养皿等均购自康宁公司；仑伐替尼与奥美拉唑药物纯品购自Selleck 公司；AhR 的小干扰RNA（siRNA）表达载体购自Santa Cruz 公司；萤光素酶报告基因检测试剂盒为Promega 公司产品；定量PCR 相关RNA提取与检测试剂盒购自Applied Biosystems 公司；有机溶剂二甲亚砜（DMSO）购自国药集团；恒温二氧化碳细胞培养箱、超净工作台等实验设备均由本实验室提供。

1.2 细胞培养与细胞抑制率检测

培养A549 和H460 细胞，收集细胞并计数，将细胞接种于96 孔细胞培养板（约8000/孔）。用DMSO 溶解奥美拉唑或仑伐替尼，再用含0.5%胎牛血清的DMEM 培养液将DMSO 溶液稀释并配置系列浓度梯度的药液（奥美拉唑的系列浓度梯度为10、3、1、0.3、0.1、0.03 及0.01 μmol/L，仑伐替尼的系列浓度梯度为1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003 及0.001 μmol/L）。以上述系列浓度梯度的药物孵育A549 或H460 细 胞48 h 后进行MTT 检测，读取D490nm值，计算 抑 制率：（对照 组D490nm值-实 验组D490nm值）/（对照组D490nm值）×100%[9]。利用抑制率计算药物作用于细胞的半数抑制浓度（IC50值）。

1.3 萤光素酶报告基因活性

化学合成5 聚体AhR 结合元件序列（GCGTG）5，将合成序列克隆到pGL4.26 载体上，所得AhR 结合元件萤光素酶报告基因载体命名为ARE-Luc。培养A549 或H460 细胞，收集细胞并计数，将细胞接种于24 孔细胞培养板（约10 000/孔）。用DMSO 溶解奥美拉唑，再用含0.5% 胎牛血清的DMEM 培养液将药物DMSO 溶液稀释并配置为系列浓度梯度的药液（奥美拉唑的系列浓度梯度为10、3、1、0.3、0.1、0.03 及0.01 μmol/L）。以上述系列浓度梯度的药物孵育A549 或H460 细胞24 h后进行萤光素酶报告基因检测，按照厂商说明书检测ARE-Luc 的活性。

1.4 定量PCR（qPCR）

培养获得A549、H460 细胞，用DMSO 溶解奥美拉唑，再用含0.5%胎牛血清的DMEM 培养液将药物DMSO 溶液稀释并配置为系列浓度梯度的药液（奥美拉唑的系列浓度梯度为10、3、1、0.3、0.1、0.03 及0.01 μmol/L）。以上述系列浓度梯度的药物孵育A549 或H460 细胞24 h 后提取细胞总RNA 进行定量PCR，检测AhR 下游基因CYP1A1及CYP1A2 的表达水平。CYP1A1 正向引物为5′-GATTGAGCACTGTCAGGAGAAGC-3′，反向引物为5′-ATGAGGCTCCAGGAGATAGCAG-3′ ；CYP1A2正向引物为5′-TCATCCTGGAGACCTTCCGACA-3′ ，反 向 引 物 为5′-GCCACTGGTTTACGAAGA⁃CAC AG-3′；内参β-actin 正向引物为5′-CAC⁃CATTGG CAATGAGCGGTTC-3′，反向引物为5′-AGGTCTT TGCGGATGTCCACGT-3′。

1.5 NSCLC细胞裸鼠皮下成瘤检测

培养获得A549 或H460 细胞，接种裸鼠皮下，3～4 d 后，动物灌胃给予溶剂对照、1 mg/kg 仑伐替尼或1 mg/kg 仑伐替尼+2 mg/kg 奥美拉唑。动物隔日给药，治疗10～15 次（3～4 周）后收集动物获得肿瘤组织，称量肿瘤重量。测量肿瘤组织的长度与宽度后，计算肿瘤体积：肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2。依据肿瘤大小与肿瘤重量计算抑制率：（对照组肿瘤大小-治疗组肿瘤大小）/对照组肿瘤大小；（对照组肿瘤重量-治疗组肿瘤重量）/对照组肿瘤重量[10-11]。

1.6 统计学分析

结果表示为x±s，用SPSS 17.0 软件，采用单因素方差分析计算P值，以P＜0.05 为具有统计学差异。用Origin 6.1 分析绘图软件计算药物作用于细胞的IC50值。

表1 奥美拉唑诱导AhR活性的半数作用浓度

图1 奥美拉唑能够在NSCLC 细胞中诱导AhR 的转录因子活性

2 结果

2.1 奥美拉唑能够剂量依赖地诱导AhR的转录因子活性

结果如图1，在A549 及H460 细胞中，奥美拉唑能够剂量依赖地诱导AhR 结合原件报告基因（ARE-Luc）的活性。在此基础上，图2 的结果显示，奥美拉唑能够在A549 及H460 细胞中剂量依赖地诱导AhR 下游基因CYP1A1 及CYP1A2 的mRNA 表达水平。表1 显示奥美拉唑作用于AhR的半数作用浓度（EC50值）。结果表明，奥美拉唑能够在NSCLC 细胞中诱导AhR 的转录因子活性。

2.2 奥美拉唑能够下调分子靶向药物仑伐替尼对NSCLC细胞的杀伤作用

奥美拉唑自身不具有对NSCLC 细胞A549（图3A）或H460（图3B）的杀伤作用。为此，选取2.1中奥美拉唑诱导AhR 活性的最大作用浓度（3 μmol/L）进行进一步实验。结果如图3 所示，奥美拉唑处理NSCLC 细胞A549 或H460，能够显著下调分子靶向药物仑伐替尼对A549（图3C）或H460细胞（图3D）的杀伤作用。表2 显示了不同组（对照组与奥美拉唑处理组）仑伐替尼杀伤NSCLC 细胞的IC50值与耐药倍数（resistance folds）。同时，转染AhR 的siRNA 能够抑制奥美拉唑诱导的仑伐替尼耐受（表2）。这表明奥美拉唑能够下调分子靶向药物仑伐替尼对NSCLC 细胞的杀伤作用，奥美拉唑的作用是依赖于AhR 的。

图2 奥美拉唑能够剂量依赖地在NSCLC 细胞中诱导AhR 的下游基因CYP1A1 及CYP1A2 的mRNA 表达水平

图3 奥美拉唑能够下调仑伐替尼对NSCLC 细胞的杀伤作用

2.3 奥美拉唑能够下调分子靶向药物仑伐替尼对NSCLC细胞裸鼠成瘤的抑制作用

结果如图4 所示，仑伐替尼能够显著抑制NSCLC 细胞A549 的皮下成瘤能力，口服灌胃给予奥美拉唑能够下调仑伐替尼对A549 细胞皮下成瘤的抑制作用。在H460 细胞中也有类似结果（图5）。这表明奥美拉唑能够下调分子靶向药物仑伐替尼对NSCLC 细胞裸鼠成瘤的抑制作用。

表2 仑伐替尼对NSCLC细胞杀伤作用的半数抑制率

图4 奥美拉唑能够下调仑伐替尼对NSCLC 细胞A549 皮下成瘤的杀伤作用

3 讨论

NSCLC 是最主要的肺部肿瘤病理类型，此外还有一些其他的病理类型，包括小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）及少见病理类型（例如其他脏器肿瘤的肺转移等）[12]。分子靶向治疗现已成为进展期NSCLC 抗肿瘤药物治疗的主要策略，有助于延长NSCLC 患者的生存期，改善患者的生活质量。但另一方面，过去的研究与临床诊疗主要以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点，相关新药研究的潜力越来越有限，同时EGFR抑制剂在临床诊疗中也存在药物耐受现象。以VEGFR 等为作用靶标的新型分子靶向药物开创了NSCLC 治疗的新时代，但治疗费用昂贵。研究与开发分子靶向药物增敏的治疗策略，通过与其他药物联合使用以实现增加药物作用效果、降低药物用量或减缓药物毒副作用等具有重要意义。

目前，NSCLC 等恶性肿瘤分子靶向治疗主要是口服EGFR、VEGFR 等靶标的抑制剂，EGFR、VEGFR 等不仅是抗肿瘤治疗的理想干预靶标，同时也是维持消化道内皮细胞存活与消化道黏膜稳定、再生的重要调控枢纽，分子靶向药物在发挥抗肿瘤作用的同时也会损伤胃肠黏膜，加重各种溃疡性疾病。奥美拉唑是一种适用于胃溃疡、十二指肠溃疡、应激性肠道溃疡等肠道出血性疾病的常用药物，被认为有助于改善分子靶向药物引起的多种肠道不适与损伤[13]。本研究结果显示，奥美拉唑能够在NSCLC 细胞中诱导AhR 的转录因子活性，进而促进NSCLC 细胞对新型分子靶向药物仑伐替尼的耐受作用。AhR 在NSCLC 组织中高表达，能够在NSCLC 增殖调控中发挥作用。AhR 的下游基因主要是各种药物代谢酶类，上调AhR 的活性能够通过上调下游基因的表达加速抗肿瘤药物代谢，造成抗肿瘤药物耐受。奥美拉唑能够上调AhR 的活性，被认为是AhR 较为典型的激动剂。本研究不仅报道了新型分子靶向药物仑伐替尼对NSCLC 细胞的杀伤作用，也揭示了奥美拉唑与仑伐替尼的潜在药物相互作用，可为相关研究提供参考。

图5 奥美拉唑能够下调仑伐替尼对NSCLC 细胞H460 皮下成瘤的杀伤作用