嗜水气单胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF的原核表达及分离纯化

刘艳菊，许永斌，王路路，陈金利，苏晓燕，黄丽菲，桂瑞英，张贺航

大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连116600

嗜水气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属，为革兰阴性短杆菌，是一种普遍存在于淡水、污水及土壤中的条件致病菌[1]。嗜水气单胞菌可分泌多种毒力因子（包括外毒素、胞外蛋白酶、结构蛋白和信号相关蛋白），可引发动物的败血症、局部皮肤溃烂和内脏器官出血等症状，同时也可使人类患有急性肠胃炎、胆膜炎和肺炎等疾病[2-3]。目前市售多种抗生素对嗜水气单胞菌有抑制或杀灭作用，但由于长期滥用导致嗜水气单胞菌的耐药性增强，因此，发现新的抗菌靶点，开发新的抗菌药物迫在眉睫[4]。

十一碳焦磷酸合成酶XreF 是嗜水气单胞菌中一个保守的属于顺式异戊烯基转移酶家族的胞内酶，具有反式结构，催化法尼基焦磷酸的链延长，缩合得到十一碳烯基焦磷酸盐[5-7]。在嗜水气单胞菌等细菌的多种细胞壁多糖组分生物合成中，十一碳烯基焦磷酸盐是糖基转移的脂质载体[8-10]。脂多糖是嗜水气单胞菌中内毒素的主要成分，毒性作用主要有热原性、白细胞数目减少或增多、弥漫性血管内凝血、神经症状及休克以至死亡等。此外，其中的抗原脂多糖还具有黏附因子的作用，而且一些脂多糖和主要外膜蛋白质形成的复合物与细胞黏附性和血凝性有关[11-13]。由于该酶在微生物中高度保守，且在细胞壁的早期合成中具有不可或缺的作用，因此十一碳焦磷酸合成酶失活途径可作为新型抗菌药物设计的靶点[14-15]。根据相关文献报道，十一碳焦磷酸合成酶是功能性同源二聚体，由2 个相对分子质量同为29×103的单体组成。目前对嗜水气单胞菌内十一碳焦磷酸合成酶的研究甚少，其具体结构与功能机理不明[16-17]。本实验旨在原核表达并分离纯化嗜水气单胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF，为进一步研究该酶的结构和功能机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜水气单胞菌由本实验室保藏；感受态大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）购自北京全式金公司；Taq酶、T4DNA 连接 酶、限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ购自大连宝生物工程有限公司；pPROEXHTa 载体购自Invitrogen（上海）贸易有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 扩增目的基因XreF

根据已知的XreF基因碱基序列（GenBank：PKD24907.1），用Primer 2.0 软件设计上游引物（GGGCCATGGATATGTCGCTTTTGGCAG，下 划 线处为NcoⅠ酶切位点）和下游引物（GGGCTCGAGTTAGCCGGTCTGTTGCTC，下划线处为XhoⅠ酶切位点），以嗜水气单胞菌基因组为模板进行PCR扩增（扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增32 个循环；72℃延伸5 min）。50 μL 扩增体系包括嗜水气单胞菌基因组DNA 模板1 μg/mL，上、下游引物各0.8 μmol/L，脱氧核苷酸混合物200 μmol/L，耐热性DNA 聚合酶0.5 U，1× Ex Taq 扩增缓冲液，加34 μL 超纯水补足。4℃保存PCR 产物，并利用1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1.3 重组表达载体pPROEX-HTa-XreF的建立和阳性克隆鉴定

取XreF基因PCR 回收产物和pPROEX-HTa载体各10 μL，分别用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，37℃反应3 h，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收含目的基因及载体的凝胶条带，向反应体系中加入T4DNA 连接酶1 μL，于16℃反应过夜，将目的片段与载体连接。用化学转化法将重组质粒转入感受态大肠杆菌DH5α，菌液涂布于含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB 固体培养基上，37℃培养过夜，次日从平板上挑取单菌落于3 mL LB 培养基中振荡过夜培养，提取质粒双酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，取阳性质粒测序。

1.4 XreF的原核表达和纯化

将测序成功的重组质粒pPROEX-HTa-XreF转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，形成稳定的高表达菌株，挑取菌落划线培养于含氨苄青霉素的LB 固体培养基中，在37℃培养箱中倒置培养过夜；通过液体LB 培养基中的预培养和扩大培养，使菌液D600nm值达到0.6～1.2，加入终浓度为0.5 mmol/L 的诱导剂IPTG，30℃诱导培养8 h。

收集菌体，用缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）悬浮后超声波破碎（超声破碎5 min，间隔10 min，超声5 次），13 000 r/min 离心30 min，弃沉淀；上清液首先经金属镍离子螯合层析（Ni2+-NTA 柱）初步分离目的蛋白后，用 洗 涤 缓 冲 液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）洗4 次，再用洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris- HCl，150 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH8.0）洗脱目的蛋白至50 mL EP管中；采用BCA 法定量测定目的蛋白浓度，用15% SDS-PAGE 进行纯化鉴定，将初步纯化的蛋白用TEV 蛋白酶切除组氨酸标签，用15% SDSPAGE 鉴定酶切结果。

用离子交换层析进一步分离纯化酶切成功的XreF 蛋白。先用缓冲液B（20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，2 mmol/L β巯基乙醇，pH8.0）清洗Q 柱，洗去残留杂蛋白，再用缓冲液A（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β巯基乙醇，pH8.0）平衡柱子，然后将用4 倍体积的缓冲液A 稀释的待纯化的蛋白质与离子交换柱结合，用缓冲液B、缓冲液A 的混合液对目的蛋白进行线性洗脱，在280 nm 波长下监测洗脱结果并收集目标样品。根据洗脱峰谱图选择样品，用15% SDS-PAGE 检测分析，回收目的蛋白，浓缩至5 mL 备用。在AKTA 层析系统中用凝胶过滤柱（HiLoad 16/600，Superdex 200pg）进一步纯化蛋白，缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β巯基乙醇，150 mmol/L NaCl，pH8.0）流速0.5 mL/min，于280 nm波长下监测结果并收集目标样品。根据洗脱峰谱图，选择样品用15% SDS-PAGE 检测分析，回收目的蛋白，浓缩后保存备用。

1.5 XreF蛋白聚集状态检测

在500 μL 0.8 mg/mL 的XreF 蛋白溶液中加入终浓度为5 mmol/L 的MgCl2溶液，室温孵育30 min 后注入Superdex75 凝胶过滤层析柱，用AKTA蛋白纯化系统设置0.4 mL/min 流速，以凝胶缓冲液（Tris-HCl 20 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，β巯基乙醇2 mol/L，pH8.0）进行洗脱；对照组蛋白不加MgCl2处理，500 μL 0.1 mg/mL 的XreF 蛋白室温静置30 min 后注入Superdex75 凝胶过滤层析柱，以相同条件进行洗脱。洗脱完成后，记录洗脱峰峰值对应的洗脱体积，依据凝胶过滤柱标准蛋白标准曲线，计算洗脱峰蛋白相对分子质量，通过与XreF 蛋白理论相对分子质量的对比，确定蛋白聚集状态，从而验证XreF 蛋白聚集状态以及镁离子对XreF 蛋白聚集状态的影响。

图1 XerF 基因片段扩增电泳图

图2 pPROEX-Hta-XreF 重组质粒双酶切鉴定

2 结果

2.1 XreF基因的扩增

以嗜水气单胞菌基因组DNA 为模板PCR 扩增目的基因，大小与XreF目的基因片段大小为774 bp，琼脂糖凝胶电泳显示扩增出1 条特异性条带，大小与XreF目的基因（774 bp）一致（图1）。

2.2 重组质粒的鉴定

将提取质粒后的重组表达载体pPROEXHTa-XreF 用NcoⅠ和XhoⅠ限制酶内切酶特异性切割后进行核酸电泳，选取3 个阳性克隆进行双酶切鉴定，泳道3 样品显示了XreF基因条带和载体条带（图2），说明重组质粒构建成功。将重组质粒测序，结果与XreF基因序列完全一致。

2.3 镍离子亲合层析

将重组质粒pPROEX-HTa-XreF 转入大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG 浓度于37℃诱导培养8 h，菌体重悬液经超声波破碎后，取上清液进行镍离子亲和层析。初步纯化后的蛋白经15% SDSPAGE 分析，考马斯亮蓝染色，3 号样品出现了相对分子质量约29×103的特异性条带，与预期大小一致，说明目的蛋白XreF 获得表达（图3）。

图3 XreF 蛋白镍离子亲和层析纯化结果

图4 XreF 蛋白离子交换层析结果

图5 XreF 蛋白凝胶过滤层析纯化结果

2.4 XreF蛋白的纯化

2.4.1 离子交换层析纯化 将切除组氨酸标签之后的目的蛋白进行离子交换层析，在洗脱峰中取样，进行15% SDS-PAGE 检测分析，结果见图4。洗脱峰虽然出现了目的蛋白XreF 的条带，但仍有部分杂蛋白。因此，收集第一个洗脱峰样品后，还须通过凝胶过滤层析进一步纯化，以提高XreF蛋白的浓度。

2.4.2 凝胶过滤纯化 将离子交换层析纯化的XreF 蛋白浓缩后进行凝胶过滤层析，在洗脱峰上取样后用15% SDS-PAGE 检测，结果见图5，获得的蛋白纯度较高。用超滤管将洗脱峰中的蛋白样品进行浓缩，经检测浓度为17.5 mg/mL。

2.5 XreF蛋白聚集检测

据文献报道，镁离子能提高XreF 蛋白酶的活性，加快其与底物的结合[18]。图6 出峰位置为18.03 mL，依据标准曲线方程y=10（-0.1306x+3.8213）计算，该洗脱峰对应的蛋白相对分子质量约29.3×103，与理论值一致，因此洗脱峰对应蛋白是XreF蛋白的单聚体。同时对照图7 可知，镁离子对XreF 蛋白的聚集状态有明显影响，出峰位置为15.70 mL，对应蛋白的相对分子质量为59×103，约为单倍体的2 倍。镁离子是这种蛋白酶发挥催化活性的的重要配体，我们的研究结果表明，XreF蛋白很可能在镁离子的诱导下，由非活性状态（单体）向活性状态（二聚体）转化。

2.6 XreF结构力分析

目前，已有包括大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌等在内的多种微生物的XreF 蛋白的晶体结构被报道，这些同源蛋白晶体结构均为二聚体，与我们检测到的嗜水气单胞菌XreF 具有相同的聚集方式。与嗜水气单胞菌XreF 序列相似度最高的为大肠杆菌XreF 蛋白，氨基酸序列相似度高达63.6%。大肠杆菌XreF 结构（PDB code：5CQB）中，每个单体延伸出的2 个α螺旋之间的疏水相互作用是二聚体形成的主要作用力。因此，从蛋白同源性角度分析，嗜水气单胞菌XreF 蛋白很可能以相同的作用力形成二聚体（图8）。

图6 未加Mg2+的XreF 蛋白聚集状态检测结果

图7 加入Mg2+的XreF 蛋白聚集状态检测结果

3 讨论

近年来，嗜水气单胞菌引发的疾病频繁发生，给我国淡水渔业的发展带来了很大挑战，经济损失严重，越来越受到公众的关注[19]。据Gen⁃Bank，嗜水气单胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF 由258 个氨基酸残基组成，其编码基因全长774 bp。XreF 负责十一碳烯基焦磷酸盐生物合成，是细菌细胞壁生物合成中的必需酶。十一碳焦磷酸合成酶是一类存在于所有生命体中的酶，具有传递信息、调节结构的功能[20]。近年来，有关嗜水气单胞菌中十一碳焦磷酸合成酶的同源蛋白研究较多。Kuo 等解析出幽门螺杆菌中十一碳焦磷酸合成酶的晶体结构并发现了相关抑制剂[20]；Inooshi 等发现绿脓杆菌毒素和螺环己烷对十一碳焦磷酸合成酶活性具有抑制作用，特别是在抗革兰阳性菌中的耐甲氧西林金黄色葡萄球[7]。但针对嗜水气单胞菌中十一碳焦磷酸合成酶的研究较少，仍是一个未充分开发的新型抗菌药物的领域。我们本次实验的目的主要是表达纯化嗜水气单胞菌中的十一碳焦磷酸合成酶，获得较高纯度的目的蛋白，为后续嗜水气单胞菌中的XreF蛋白三级结构研究、晶体结构解析奠定基础，也为其相关新型抗菌药物的研发提供材料。

图8 大肠杆菌XreF 蛋白二聚体形成方式