宫颈癌患者三维能量多普勒超声下血流情况与HPV分型的相关性研究

孙海婷，王莹莹，项小苗，陆敏莉

血管生成是宫颈癌的浸润、生长及远处转移的重要原因之一。关于宫颈癌血管生成及如何对其抑制是治疗宫颈癌的重要出路，因此一直是研究的热点。超声是目前无创评估血流的常用方法，具有便宜、快捷、易操作和可重复多次实施等特点；三维能量多普勒（3D-CPA）属于定量分析方法，可准确分析和计算宫颈内血流的分布，是既无创且可靠的新方法之一。本研究采用3D-CPA技术检测血管指数（VI）和血管分级[1]。有文献报道，随着高危型人类乳头瘤病毒（HRHPV）负荷量增加，宫颈高度上皮内瘤变（CIN）和宫颈癌的发生率明显高于负荷量低的HR-HPV患者[2]。研究发现HPV E6促进血管内皮生长因子（VEGF）的过度表达，从而促进宫颈癌的转移和浸润[3]。VEGF是近年发现的与肿瘤血管形成有关的最强的促肿瘤血管生成的分子之一，也与宫颈癌的发生发展息息相关[4]。VEGF一直被认为与血管生成相关，HPV E6可促进VEGF的表达，高危型HPV是否也通过相同的通路刺激血管的生成？本文旨在对此问题进行研究，为今后宫颈癌的诊疗提供依据。现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 选择宁波市象山县第一人民医院2015年6月至2017年6月于本院住院的宫颈癌患者98例，采用原位 PCR杂交和免疫组织化学法检测HPV16/18感染，根据检测结果将病例分为 4组，仅 HPV16阳性为 32例为HPV16组；仅 HPV18阳性为25例为HPV18组；HPV16和18均阳性18例为HPV16+18组；两者皆阴性、且低危型HPV阳性为对照组共23例。纳入标准：经阴道镜取材活检证实为宫颈癌患者、未接受放疗及化疗等干预、3D-CAP检查后1个月内接受手术切除术；排除标准：患者正参与另外一项药物或医疗器械临床试验、不能配合检查的神经障碍或其他严重疾病患者、具有任何需要急救的紧急医疗状况。各组宫颈癌国际妇产科联盟（FIGO）[5]临床分期及病理类型的构成比差异均无统计学意义（均＞0.05），见表 1。

1.23D-CPA检测 对各组研究对象行经阴道宫颈三维超声（PHILIPS iu22超声诊断仪）成像，采用QLAB软件分析宫颈的体积。启动能量多普勒（CPA）检测技术，对宫颈的血管进行三维成像，检测过程中对宫颈进行动态旋转，已达到充分显示血管分支和立体走行的效果。参考文献[6]对三维成像显示出的宫颈血管进行分级，其中0级：宫颈周边及内部未见血流信号；I级：宫颈周边可见短条状或点状分布的血管，宫颈内未见无血管分布；Ⅱ级：除宫颈周围可见血管，宫颈内部也可存在稀疏的血管分布，走行较平直分支简单；Ⅲ级：子宫颈内可见密集的血管网和/或血管树，走行扭曲、分支复杂且不规则。软件计数宫颈中的血管总数以及其与宫颈体积的比值即单位宫颈体积的血管条数，此比值为血管指数（VI），它可体现宫颈血供情况。血管数量由3位有经验的超声科医生分别计数3次，取平均值作为最终值。

1.3免疫组化染色 手术切除术后选取各组研究对象的宫颈部位的组织切片，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶（S-P）免疫组化法染色。一抗为鼠抗人VEGF单克隆抗体和CD34单克隆抗体，操作按照抗体说明书操作。

1.4微血管密度（MVD）的计数CD34可标记血管内皮细胞，呈棕黄色染色为阳性。癌细胞的间质内存在孤立的棕黄色血管腔面积小于8个红细胞、血管内皮细胞或细胞簇，且无肌层管壁者为1条独立的微血管。病理医生在低倍镜下（×200）（Olympus生物显微镜）下检查微血管的染色情况，取3个癌巢最多间质血管视野作为血管热点区，高倍视野下（×400）计数每个区域的MVD，平均值记为该例肿瘤的MVD值。

1.5VEGF阳性判定 VEGF主要位于细胞质，肿瘤细胞胞质中出现棕黄色颗粒定义为阳性细胞。选择5个高倍视野下计数肿瘤总细胞数和阳性细胞的个数，阳性细胞/肿瘤总细胞数得出阳性细胞百分率，阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；无特异性染色为0分，染色强度黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；两者积分相乘，0～1分为阴性（－），2～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（2+），9～12分为强阳性（3+）。

1.6HPV检测 采用深圳亚能生物技术公司提供的 PCR-反向点杂交法能够检测5种低危亚型（HPV6、11、42、43、44）和 18种高危亚型（HPV16、18、33、35、31、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、84、MM4），此检测法可检出HPV的最小拷贝数为1.0×103copies/ml，结果按芯片上相应着色位点分布判读出HPV亚型。

1.7观察指标 3D-CPA检测下的血管分级及病理下的MVD、VI及VEGF阳性细胞计数。

1.8统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差，多组内比较采用检验，多组间两两比较采用LSD-检验；计数资料采用2检验＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.14组VEGF表达比较 4组VEGF阳性率差异有统计学意义（2=13.82，＜0.05），其中对照组明显低于HPV16组、HPV18组及HPV16+18组（2=4.02、5.60、13.24 均＜0.05）。见表2。

表1　各组临床分期及病理类型的构成比比较 例

2.2血管分级下 HPV感染亚型比例趋势分析 所有病例无0级血流，对照组I级比例明显高于 HPV阳性各组（2=10.29、10.50、6.71，均＜ 0.05）。对照组III级比例明显低于HPV阳性各组（2=6.15、6.27、2.51，均＜ 0.05），II级血流比例比较差异均无统计学意义（2=1.04、0.64、0.24，均＞0.05）。见表3。

2.34组 MVD值及 VI值比较 4组MVD值和 VI值差异均有统计学意义（均＜0.05），其中对照MVD值和VI值明显低于 HPV16组、HPV18组和HPV16+18组（均＜0.05）。见表4。

3　讨论

高危型HPV16/18感染一直被认为与宫颈癌的发病密切相关，其与宫颈癌肿瘤MVD及三维超声下VI的关系的研究报道较少。有人在研究胡萝卜素对血管形成的作用中同时发现，用带HPV16/18基因组的宫颈癌细胞株Skvt和Hela注入裸鼠皮下，肿瘤血管形成的能力明显高于HPV16/18基因的细胞株细胞[7]。在研究14-HPV16转基因小鼠的过程中发现，微血管计数、VEGF mRNA（VEGFmRNA）表达量与 E6/E7mRNA的表达量呈正相关，因此推测HPV16/18病毒感染可以上调VEGF，从而促进肿瘤的浸润转移[8]。国内研究结果显示，在原位癌和浸润癌中，HPV16/18感染率增加与 MVD间无明显相关，提示高危型HPV16/18病毒在宫颈癌的微血管的生成可能并非起直接作用[9]。本研究其中一部分重复了类似的试验，且结果显示高危型HPV16/18感染的宫颈癌患者，MVD与VEGF表达水平均明显高于低危型感染者，与过去研究结果有差异，具体原因需要进一步从信号通路上进行探讨。

研究证实，CIN发展成宫颈浸润癌的过程中，均存在不同程度血管生成，随着病变恶化，病变中的MVD及多种血管生成诱导因子如 VEGF表达显著增加，后者表达水平与预后密切相关[7,10]。3D-CPA将多普勒信号与空间定位相结合，从三维方式的角度立体呈现脏器及病灶内处的血流分布。三维能量多普勒定量分析法为分析和准确计算宫颈病灶内外的血流分布提供了一个无创的新方法。VI是宫颈单位体积内的血管数量，可直观呈现肿瘤血供情况的重要指数。区域VI值越高，代表区域的新生血管越密集[11-12]。有研究发现宫颈癌、CIN及正常患者的宫颈VI值存在显著差异，VI用于诊断宫颈癌的AUC为0.848，可见VI不仅仅是体评估肿瘤血管新生的好工具，同时也是良恶性判断的有效指标[13]。本研究尝试使用3D-CPA对研究对象的病灶血流进行分析结合病理指标MVD和VI，结果显示3D-CPA所得血管分级结果为非HPV感染病例（对照组）血管分级I的比例明显高于HPV阳性各组，而分级III比例明显低于各组；于此对应的病理结果显示对照组的MVD值与VI值均不同程度的低于HPV阳性各组。

表2　各组VEGF表达比较

表3　血管分级下HPV感染亚型比例趋势分析 例（%）

表4　各组MVD值及VI值比较

本研究还提示高危型患者VEGF表达水平高，可能是血流旺盛的主要原因之一。综上所述，HPV16/18宫颈癌患者病变血流更为丰富，可能与预后有着密切关系，具体机制有待进一步研究证实。

参考文献：

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