富含血小板血浆明胶在胫骨粉碎性骨折愈合的应用

茹正良，吴明义，景孟军

血小板是多种细胞因子和生长因子的储存库，这些细胞生长因子能促进血液凝固、组织修复和骨化过程。富含血小板血浆（PRP）是少量的血浆内包含大量的血小板成分的血制品，PRP通过生长因子例如血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子及转化生长因子 等起促进成骨[1-3]，已成功应用于下颌骨和脊柱的骨移植手术、心血管手术和相关的代谢性骨疾病等[4]。以往研究中PRP应用于促进扁骨和松质骨骨折愈合，而且缺乏载体，本实验研究PRP承载在明胶上对长骨粉碎性骨折的影响。现报道如下。

1　资料与方法

1.1动物、试剂材料

1.1.1健康成年大鼠40只，雌雄不限，体质量400～600 g，均购自浙江中医药大学动物实验中心。

1.1.2试剂 抗凝剂枸橼酸钠（浙江中医药大学附属第一医院检验中心）；BMP-2、VEGF抗体、凝血酶（杭州厚爱生物技术有限公司）。

1.1.3材料 克氏针、钢丝锯、青霉素、注射器、血管钳、复合碘、一次性无菌巾、无菌手套、无菌敷料、线剪、手术刀及缝合用针线等（浙江中医药大学附属第一医院提供）。

1.2方法 将40只大鼠中4只作为取血源，剩下36只大鼠用随机数字法分成实验组和对照组，每组18只。

1.2.1PRP明胶制作 杀死4只大鼠，取全血60 ml，分别加入含有枸橼酸钠溶液的试管中，采用二次离心方法制备PRP。1 500 r/min离心20 min，巴氏管吸取上部的血浆及靠近界面1mm的红细胞转移到另一离心管中。进一步2000 r/min离心10min，可见在底部薄层的红细胞上沉积有白膜样物质，即为血小板沉积层；其上部为含有极少量未沉降血小板的血浆层。巴氏管吸取上部大部分血浆，剩下约0.5 ml血浆及血细胞成分。静置30 min后轻轻振摇离心管，使红细胞和血小板重悬于剩余的血浆中，即为PRP，最终得到全部的PRP 5 ml。将明胶海绵裁剪成0.5 cm小条，浸泡于PRP液中，即得到富PRP明胶。

1.2.2动物模型制备 36只大鼠行头部及四肢固定于操作台上，取右后肢常规方法脱毛灭菌，于胫骨中段处行长3 cm纵行切口，沿肌间隙游离胫骨，切开骨间膜及骨膜，近似横行锯断胫骨，人为造成一处蝶形骨片，直视下远近断端完全分离，利用克氏针倒打钉技术复位并同时固定骨折断端，冲洗创面，实验组骨折线处覆上PRP明胶，对照组骨折处覆盖空白明胶，逐层缝合，无菌纱布包扎。术后即下地，青霉素肌注3 d，隔日换药，2周拆线。两组大鼠分别在建模后1、2及4周行X线检测，拟每个时间点两组分别取6只行X线评价。

1.3观察指标 骨痂X线评分标准：骨折断端表现未见骨痂为Ⅰ级（0分）；断端边缘模糊，其骨膜反应较浅淡，有少量骨痂，密度淡，边缘不平整为Ⅱ级（1分）；断处边缘已接近消失但仍可见，骨膜反应深，其骨痂量增多，未达到将缺损填满，边缘较清晰，密度增加为Ⅲ级（2分）；断处边缘已完全消失，其骨膜反应密度已近似骨影，缺损被骨痂填满，并与骨皮质密度一样且相互连接为Ⅳ级（3分）。免疫组化检测：第1周大鼠死亡6只，第2周死亡2只。第1周分别取5、4只，第2周分别取5、5只，第4周取4、5只。将X线检查后实验大鼠杀死，以骨折断端为中心取长2.0～3.0 cm的骨组织标本作免疫组化检测。

1.4统计方法 采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用 检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组骨痂大体形态 建模后对照组1只出现感染，3只（对照组2只，实验组1只）伤口局部出现轻度的红肿，应用抗生素和伤口换药处理后愈合良好，其余未发现伤口局部异常情况；两组在建模后1、2周时，均有不同程度纤维连接形成，第4周出现明显骨痂；前2周大鼠骨折部位以纤维连接为主，实验组的纤维连接强于对照组，两组骨折线清晰，无明显的骨痂生成；4周时两组骨折线模糊，仅少量骨折部位骨折线清晰，骨折部位存在不等量的骨痂，且实验组多于对照组。

2.2X射线检测结果 建模后第1周两组均无明显的骨痂形成，两骨折断面清晰。第2、4周连续检测发现骨折断端逐渐模糊，骨痂影逐渐的增大，骨折部位出现了硬性骨痂。实验组 X线评分（2.80±0.47）分，对照组（2.25±0.50）分，差异有统计学意义（=7.95＜ 0.05）。

2.3免疫组化结果 根据大鼠处死时间分为第一批、第二批及第三批。两组第一批、第二批及第三批大鼠骨标本中BMP-2、VEGFA含量差异均有统计学意义（均＜0.05）；随着时间推移，第三批BMP-2、VEGFA含量达到最高。见表1～2。

3　讨论

本组采用二次离心方法制备PRP明胶，这种制备方法成熟简便、易于操作，要求在尽可能无菌条件下完成，在制备的过程中尽可能减少不必要操作。明胶具有良好的生物相容性、生物降解性、骨传导性及免疫原性低，有一定的强度及初性、高孔隙率。PRP承载于明胶能有效防止PRP流失，使细胞因子持续作用于骨折断端。杀死大鼠取全血过程中，可能混杂有其他成分，这需要提高操作精度或者提升工艺来提纯。

本研究动物模型取大鼠后肢胫骨中段，造成胫骨粉碎性骨折模型，这种骨折模型操作相对单纯，更加符合临床实际运用，易于在直视下将PRP明胶植入骨折部位并可以观察植入情况。骨折模型建立后行克氏针内固定，这在解剖基础上能够加强骨折部位稳定性，比石膏夹板外固定更加可靠。笔者在造模中碰到的主要问题是骨折类型的不一致，目的是大致横断骨折加一个蝶形骨片，横断骨折因为用锯子还是很容易达成，但是用暴力制造蝶形骨片还是碰到了困难，很容易造成骨片的粉碎，后来临时增加大鼠补足了实验数目。

表1　骨痂中BMP-2含量表 g

表2　骨痂中VEGFA含量表 g

因为骨折的修复经历血肿形成、血肿机化、骨痂形成和骨痂改建4个阶段。当成骨大于或等于破骨的时候，骨损伤的修复过程才能顺利进行，当骨的稳定受到破坏时，则需要新生骨组织修复创伤造成的缺损，此时可见大量毛细血管自骨折端长出，为骨修复提供所需的因子、细胞及养料，直至软骨基质骨化并进一步形成骨组织[5]。在骨的生长及修复过程中，人们发现骨形成蛋白（BMP）是一类具有骨诱导性的因子，其中BMP-2是转化生长因子 家族成员之一，具有诱导未分化间充质肝细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向转化与增殖能力，具有促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨生长发育及其重建过程，进而加速骨折修复[6]。VEGF为特征性的内皮性生长因子，在体内体外，正常生长发育和病理过程中都可以特异性促进血管内皮细胞的增殖和诱导血管生成，包括内皮及内皮源性细胞、软骨及骨细胞在内的多种细胞都可以分泌VEGF，其家族成员有VEGFA、胎盘生长因子（PLGF），VEGF-B、-C、-D和E[7]。通常所熟悉的VEGF—般是指VEGF-A，广泛分布于各种组织以骨及心脏组织数量最多，有多种亚型，每种亚型都有各自不同的生物性能在血管生成中发挥相应作用[8]。

BMP对成骨的诱导为级联过程，大致可分为4个阶段[9]：（1）趋化阶段。植入后0～3 d，局部基质干细胞的形态、行为和数量出现改变；（2）分化阶段。植入后4～l0d，基质干细胞开始分化，可观察到软骨类细胞出现如软骨祖细胞，伴随多种结缔组织细胞的迁移；（3）骨质形成阶段。软骨基质在植入后10～20d开始合成，并在植入物的有血管区发生软骨内成骨，出现骨细胞并有沉积形成新生编织骨，软骨组织形成于无血管区；（4）改建阶段。植入后2～30d，新生骨趋于成熟，编织骨不断重塑逐渐形成具有骨髓的板层骨。选择第1、2及4周符合骨诱导周期，能更好地观察其中的改变。

本实验结果显示 PRP具有明显的促进骨折愈合作用，这显示PRP作为自体生物材料优势。首先，取材特别广泛，价格低廉；其次，具有很强安全性，能够减少植入材料引起的一系列并发症如疾病传播和免疫反应等；另外，其制备过程简单、易于操作。这些优势决定了PRP应用前景，但由于当前备PRP制备方法不同而导致了不同结果，这就对PRP作用产生很大争议，限制了PRP应用前景。很多专家学者仅对单一细胞因子或2种细胞因子对骨折愈合或软组织愈合作用影响进行研究，但少量却种类众多细胞因子对骨折局部共同作用机制仍不清楚，目前需要进一步完善PRP中细胞因子种类检测及相关作用以及对骨折愈合过程作用（协同效应或抑制效应）。需进一步明确PRP应用于临床后，在骨折局部持续具体时间，以及局部产生反应及如何反应等。伴随着上述一系列问题解决，PRP将进一步应用于临床并取得良好效果。

参考文献：

[1] 孙涛,栾景杰,高复峪,等.富血小板血浆对四肢粉碎性骨折患者骨折愈合的影响[J].中国医药导报,2016,13(36):117-119.

[2] Welbrich G,Kleis WK,Hafner G,et al.Growth factor levels in the platelet-rich plasma and correlations with donor age,sex,and plateletcount[J].JCraniomaxillofac Surg,2002,30(2):97-102.

[3] Sánchez AR,Sheridan PJ,Kupp LI.Is platelet-rich plasmatheperfect enchmancementfactor?Acurrentreview[J].Int JOral Maxillofac Implants,2003,18(1):93-103.

[4] Richmond JC.Arthroscopy classics.Vascularity for healing of meniscus repairs.Arthroscopy[J].2010.26(10):1368-1369.

[5] Vascellari A,Rebuzzi E,Schiavetti S,etal.All-insidemeniscal repair usingthe FasTFix meniscal repair system:isstill needed to avoid weight bearing?A systematic review[J].Muscxiloskelet Surg,2012,96(3):149-154.

[6]Chen G,Niemeyer F,Wehner T,etal.Simua tion of thenutrient supply in fracturehealing[J].JBiomech.2009,42(15):2575-2583.

[7] Ferrara N.Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis[J].Kidney Int.1999,56(3):794-814.

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[9] Gao SG,Liu H,Li KH,etal.Effectof epime dium pubescen flavonoid on bonemineral statusandboneturnoverinmaleratschronically exposed to cigarette smoke[J].BMC Mus culoskelet Disord,2012,19(13):105.