美洲大蠊黄酮提取工艺条件研究

2018-04-10程吉云周文靖

安徽农业科学 2018年10期

程吉云，岳明，王涛，周文靖，许龙

(佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯 154007)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.),俗称蟑螂、偷油婆、灶蚂子等，其虫体内含有极丰富的营养和功能性成分，包括蛋白质、维生素、几丁质等。现代医学研究表明，黄酮类物质在医学上具有许多作用，如抗癌、增强免疫能力、保护心脑血管等，黄酮类物质成为天然活性成分研究的重点对象之一[1]。研究资料表明，植物体内含有丰富的黄酮类物质，但是动物体内含量相对较少，尤其是昆虫体内研究的较少。为研究如何从昆虫体内最大剂量地提取活性最大的黄酮物质，笔者以美洲大蠊为研究对象，通过分析不同提取温度、不同提取时间和不同料液比对美洲大蠊体内黄酮提取率的影响，参考相关文献[2-8]，确定最佳提取条件，期望为美洲大蠊的相关研究提供理论支撑。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1原料。该试验所使用的美洲大蠊来自于河北省国中药材市场，经罗志文副教授鉴定为美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)隶属于蜚蠊目(Blattaria)鳖蠊科(Corydidae)，该药材及样品被保存在佳木斯大学的应用昆虫研究所。

1.1.2主要仪器与试剂。TU-1800/800S型紫外线可见分光光度计；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵； HHW-21CU-600电热恒温水槽及电热鼓风干燥箱；RE-52AA旋转蒸发器(索氏抽提器)；芦丁标准品；石油醚；甲醇；正丁醇等。

1.2方法

1.2.1原料处理。美洲大蠊分拣较严格，要求不含杂质。将分拣好的美洲大蠊置于冰箱速冻后使用电热鼓风箱进行干燥处理(温度设定为55～60 ℃)。将干燥的美洲大蠊粉碎过60～80目，然后使用石油醚对美洲大蠊粉末进行脱脂处理。

1.2.2黄酮液的提取。准确称取美洲大蠊粉制品3.33 g置于抽提器中，并在其中加入石油醚3.34 mL。将抽提器置于70 ℃恒温水浴锅中，提取脂肪，滤除滤渣。在室温环境下使用100 mL 浓度为50%的甲醇将其浸泡36 h，每3 h对其摇动1次，继续抽滤，使用提取溶剂反复对滤渣进行洗涤3次。最后将滤液合并，舍弃滤渣，待滤液中的甲醇挥发后定容于100 mL的容量瓶中。

1.2.3黄酮含量的测定。标准曲线的制定：精确称取芦丁标准品10 mg，用50%甲醇转溶于50 mL容量瓶，并定容至刻度，得0.20 mg/mL标准溶液。分别精确吸取0、1、2、3、4、5 mL上述溶液置于10 mL容量瓶内，分别加入0.3 mL 5%等体积亚硝酸钠溶液，振荡摇匀后静置5 min，分别加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀后再静置5 min，再加入4%氢氧化钠4.0 mL，最后用50%甲醇稀释定容，静置30 min，用紫外可见分光光度计测定波长496 nm的吸光度值。采用DSP数据处理软件处理，得到工作曲线回归方程：A=0.011 6C+0.013 7(C为浓度，μg/mL；A为吸光值；相关系数R=0.995)，见图1。

图1　芦丁标准曲线Fig.1　Standard curve of rutin

采用移液管吸取上述样品提取液0.1 mL滴入10 mL的容量瓶内，再向该容量瓶中加入5%亚硝酸溶液各0.3 mL，轻轻振荡容量瓶保证溶液均匀后静置5 min。再加入浓度为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，同样轻轻振荡容量瓶后静置5 min。再加入浓度为4%的氢氧化钠溶液4.0 mL，轻轻振荡后采用浓度为50%的甲醇分别稀释后定容，轻轻晃动摇匀后静置30 min。用紫外分光光度计测定该溶液在波长496 nm波长下的吸光度值A，使用相应的公式计算黄酮含量。

1.2.4不同因素提取试验。使用不同的温度、时间、料液比分别对脱脂后的美洲大蠊粉末中的黄酮物质进行提取，测定所提取黄酮的含量，并将其换算为100 g干黄酮的提取率。

2　结果与分析

2.1提取温度对黄酮提取率的影响由图2可知，提取温度在美洲大蠊黄酮的提取过程中扮演着十分重要的角色。该试验过程所使用的酒精浓度为90%，提取时间固定为8 h，分别使用不同料液比[1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)]对美洲大蠊中黄酮的成分进行提取。提取温度设定在25～65 ℃，可以看出随着温度的提升，美洲大蠊的黄酮提取率逐渐增高。虽然温度对黄酮提取率有影响，但是黄酮提取率所受影响程度不太大，并且5种不同料液比条件下，黄酮提取率受温度影响程度比较一致。综合考虑溶解度和能耗等因素，最后确定美洲大蠊黄酮提取温度确定为25 ℃。

图2　提取温度对黄酮提取率的影响Fig.2　Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.2提取时间对黄酮提取率的影响图3显示的是提取温度为25 ℃，料液比为1∶4(g/mL)的条件下，使用浓度不同的乙醇对黄酮进行提取，黄酮提取率随提取时间的变化过程。可以看出，提取时间对美洲大蠊黄酮类化合物的提取率具有明显的影响。随着提取时间的推进，乙醇不断溶解更多的黄酮类化合物。当乙醇浓度在55%～65%时，当提取时间超过12 h之后，黄酮类化合物的提取率变化比较缓慢；当乙醇浓度为75%～90%时，在提取时间为4～12 h范围内，随着提取时间的增加，黄酮提取率显著增加，但超过24 h后，黄酮提取率变化不明显。因此得出，美洲大蠊黄酮最佳提取时间为12 h。

图3　提取时间对黄酮提取率的影响Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate of flavone

2.3料液比对黄酮提取率的影响提取液的配比对黄酮提取率也会产生明显的影响。图4显示的是乙醇浓度为90%、提取温度为25 ℃条件下，不同料液比提取黄酮的试验过程，提取时间分别为8、12、 24、 48 h。可以看出提取时间的增加会在一定程度上提升黄酮类化合物的提取率；并且随着料液比的增多，美洲大蠊黄酮类化合物的提取率也在逐渐提升。同时也可以看出，随着提取时间的增加，料液比为1∶4～1∶8(g/mL)，美洲大蠊黄酮提取率的变化最为明显；当料液比超过1∶8(g/mL)时，美洲大蠊黄酮提取率的变化逐渐趋于平稳。

图4　料液比对黄酮提取率的影响Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

随着料液比的提升，提取时间为8 h条件下，提取的美洲大蠊黄酮含量变化较大，随着提取时间的增加，其提取率变化不明显。

由图4可以看出，12～48 h阶段，美洲大蠊黄酮类提取率的变化趋势比较接近，且变化幅度不大；纵向分析图4可以看出，料液比为1∶8～1∶12(g/mL)，黄酮类化合物的提取率变化缓慢，增幅较小。因此，综合考虑各种因素最终确定美洲大蠊黄酮最佳提取料液比为1∶8～1∶12(g/mL)。为了节省成本，可将料液比缩小至1∶8(g/mL)。