蛹虫草摇瓶菌种培养基的优化

龙海涛，刘 标，颜小明，郝继伟

(临沂大学生命科学学院，山东临沂 276000)

蛹虫草，又名北虫草，学名北冬虫夏草，因其化学成分和药理作用与冬虫夏草相似[1-2]，在临床上常代替冬虫夏草入药[3]。现代医药学研究证明，虫草中含有虫草素、虫草酸以及各种氨基酸等营养物质，具有滋肺补肾、止血化痰、抗各类细菌、提高免疫力、降血压等功效，具有较高的食用和药用价值[4-5]。

蛹虫草经多年研究，现已实现规模化人工培养和深层发酵2种应用方式。规模化人工培养既可为人们提供大量的虫草子实体(子座)，又可为提取虫草素、虫草多糖等活性物质提供原材料，而人们通过深层发酵可直接从菌丝体以及发酵液中提取有效成分[6]。但不论哪一种应用方式，高质量、高标准的摇瓶菌种都是生产中最重要的一个环节。鉴于蛹虫草在临沂研究较少、尚未大面积推广的现状，笔者在许庆国等[7]、王战勇等[8]研究的基础上，以当地主栽品种为研究对象，尝试寻找复合碳源和复合氮源与无机盐最佳配比，以优化摇瓶菌种培养基，为后继研究和生产提供基础数据。

1　材料与方法

1.1供试材料

1.1.1菌种。采自费县盛成农业科技有限公司的蛹虫草子座，通过组织分离法得到试管母种。

1.1.2仪器设备。VS-840KVU型生物超净工作台(苏州安泰)；HZQ-Q型全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；YXQ-LS-50S Ⅱ 型全自动立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；FA2004N型电子天平(苏州安泰)；010A-1E型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器总厂)等。

1.1.3培养基。

1.1.3.1母种培养基。马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 000 mL。

1.1.3.2液体菌种基础培养基。葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

1.1.3.3碳源初选培养基。分别以20 g/L蔗糖、20 g/L乳糖、20 g/L可溶性淀粉、200 g/L马铃薯、200 g/L红薯取代基础培养基中的葡萄糖为碳源，pH自然。

1.1.3.4氮源初选培养基。分别以10 g/L酵母浸膏、20 g/L 麦麸、10 g/L牛肉浸膏、10 g/L豆粕取代基础培养基中的蛋白胨为氮源，pH自然。

1.2试验方法

1.2.1斜面菌种制备。蛹虫草子座经消毒后，在其内部取0.5 cm2左右大小的组织块，在无菌条件下接种到斜面培养基中部，置于23 ℃的培养箱中培养15 d左右，即可得蛹虫草的斜面菌种。挑选无污染、健壮的菌种备用。

1.2.2液体菌种制备。将配制好的液体培养基，按每瓶150 mL的量倒入干净的250 mL三角瓶中，用透气封口膜封口并用牛皮纸包裹瓶口，于121 ℃下灭菌20 min。冷却后，通过无菌操作取1块0.5～1.0 cm2的母种块接入液体基础培养基中。20 ℃、120 r/min振荡培养5 d，在瓶中即可看到大量菌球形成。

1.2.3发酵试验。无菌条件下按10%(V/V)的接种量用无菌吸管吸取液体菌种，接种于灭菌后的相应液体培养基中，20 ℃、120 r/min振荡培养6 d。

1.2.4菌丝重量测定。发酵试验后将无污染三角瓶中的菌体与培养液的混合物置于孔径为0.125 mm的网筛上过筛，用蒸馏水冲洗3次后，置于60 ℃干燥箱内至干燥至恒重，称重。

1.3试验设计

1.3.1碳氮源初选试验。以蛹虫草菌丝干质量为指标，以液体菌种基础培养为对照，分别通过碳源初选培养基和氮源初选培养基，筛选出适宜于蛹虫草液体发酵的碳源和氮源各2种。

1.3.2碳氮源正交法优选试验。根据碳氮源初选试验结果分别选择表现最好的2种碳源和2种氮源作为4个试验因素，并分别取3种适宜浓度作为3个水平，采用L9(34)正交表进行碳氮源的优化组合试验。

1.3.3无机盐及维生素正交优选试验。以优化碳氮源配比为基础培养基，以KH2PO4、MgSO4·7H2O以及VB1为3个试验因素，并分别取3种浓度为3个水平，采用L9(34)正交表进行常用无机盐与VB1的优化组合试验，试验设计见表1。

表1无机盐与VB1正交优化试验因素与水平

Table1FactorsandleveloforthogonaloptimizationtestofinorganicsaltandVB1

水平Level因素FactorAKH2PO4g/LBMgSO4·7H2Og/L空列Vacantcolumn D VB1 g/L10.50.5—021.01.0—0.0531.51.5—0.10

2　结果与分析

2.1碳氮源初选试验结果碳氮源初选试验结果见图1、2。经初级筛选得到最佳碳源为红薯和可溶性淀粉；经初级筛选得到最佳氮源为酵母膏和牛肉膏。

图1　碳源初选试验结果Fig.1　Primary selection test result of carbon source

图2　氮源初选试验结果Fig.2　Primary selection test result of nitrogen source

2.2碳氮源优化试验结果根据碳氮源初选试验结果，参与碳氮源优化试验的试验因素及水平见表2。

由表3极差分析结果可知，红薯取第1水平、可溶性淀粉取第2水平、牛肉膏取第2水平、酵母膏取第2水平为最佳配方。即蛹虫草液体培养基最佳氮源配比为红薯50 g/L、可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L。根据极差R值大小可知，4个试验因素对试验指标影响程度的大小排序为牛肉膏、红薯、酵母膏、可溶性淀粉。

表2碳氮源正交优化试验因素与水平

Table2Factorsandleveloforthogonaloptimizationtestofcarbonsourceandnitrogensource

水平Level因素FactorA红薯SweetpotatoB可溶性淀粉SolublestarchC牛肉膏BeefextractD酵母膏Yeastextract15055521001010103150151515

表3碳氮源正交试验极差分析结果

Table3Rangeanalysisresultsoforthogonaltestofcarbonsourceandnitrogensource

试验号No.A红薯SweetpotatoB可溶性淀粉SolublestarchC牛肉膏BeefextractD酵母膏Yeastextract菌丝干质量Dryqualityofmyceliumg/L1111126.042122232.843133316.514212323.365223119.476231226.477313217.678321320.499332118.58K125.1322.3624.3321.36K223.1024.2724.9325.66K318.9120.5217.8820.12R6.223.757.045.54

2.3无机盐及维生素正交优选试验结果由表4极差分析结果可知，最佳无机盐配比为KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB10.10 g/L。根据极差R值大小可知，4个试验因素对试验指标影响程度的大小排序为KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1。

2.4优化配方验证试验结果以表4中菌丝产量最大的配方即红薯50 g/L、可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB10.10 g/L，验证正交试验优化配方，试验结果见表5。结果表明，优化配方菌丝产量为36.33 g/L，高于对照11.31%，达极显著水平。

表4无机盐及VB1正交试验极差分析结果

Table4RangeanalysisresultsoforthogonaltestofinorganicsaltandVB1

试验号No.AKH2PO4BMgSO4·7H2O空列VacantcolumnDVB1菌丝干质量Dryqualityofmyceliumg/L1111126.332122230.753133322.794212331.685223133.736231231.077313233.528321336.269332129.09K126.6230.5131.2229.72K232.1633.5830.5131.78K332.9627.6530.0130.24R6.335.931.212.06

3　讨论与结论

在类似的蛹虫草液体菌种培养基优化研究中，许庆国等[7]认为马铃薯和蔗糖为最优碳源，牛肉膏和蛋白胨为最优氮源；邹湘月等[9]认为最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为麸皮。该研究的蛹虫草液体菌种最佳配方为红薯50 g/L、可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、VB10.10 g/L，主要碳氮源与许庆国等[7]、邹湘月等[8]不同。分析最主要的原因是菌种差异，其次是培养条件所致。此外，由于配制培养基所利用的各种农产品地域及品种的不同以及牛肉膏、蛋白胨等复合材料生产厂家和生产原料的差异，其有效成分均有所不同[10]。

该研究配方在20 ℃、120 r/min的条件下振荡培养6 d，菌丝干质量可达36.33 g/L，较许庆国等[7]的研究结果明显偏高，表明当地蛹虫草品种应用该配方有较高的生产潜力，该研究成果对促进地方蛹虫草生产与推广有一定的应用价值。

表5　优化配方验证试验结果

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

Note:Different small letters within the same column mean significant differences (P<0.05),different capital letters within the same column show extremely significant differences (P<0.01)

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