LC-MS/MS法测定大鼠血浆中5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮浓度

李备，周颖，常秀亭，罗小菊，云永欢，曹献英

1.海南省食品检验检测中心，海南 海口 570311；2.海南大学 食品学院，海南 海口 570228

中药高良姜具有散寒止呕、温胃止痛的功效，二苯基庚烷类化合物是其重要的生物活性成分，在抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等方面表现出较好的药理活性[1-5]。5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮（DPHA）是高良姜中重要的二苯基庚烷类成分（结构式见图1），具有上述活性[6-12]。本研究建立了测定大鼠血浆中DPHA浓度的LC-MS/MS方法，为高良姜二苯庚烷类成分的药动学研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级SD大鼠（10周龄，体重240±20 g）由长沙市天勤生物技术有限公司提供［动物合格证号：SCXK（湘）2014-0011］。

Prominence UFLC液相色谱仪（日本岛津公司）通过Turbo V离子源接口串联AB-SCIEX API 4000+串联四级杆质谱仪，Analyst软件控制数据采集和处理（美国AB公司）；5922型冷冻离心机（日本Kubota公司）；XS105DU十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LabTow⁃er EDI15超纯水一体机（美国热电公司）；Vibrax圆周振荡器（德国艾卡公司）；FDB03DD氮吹仪（英国Techne公司）；色谱级甲醇（德国默克公司）；色谱级正己烷和甲酸（阿拉丁试剂）。

1.2 供试品溶液的制备

精密称取DPHA对照品适量，加甲醇配制成0.1 mg/mL的储备液，4℃保存备用。取益智酮甲对照品适量，精密称定，加甲醇配制成200 ng/mL内标溶液。

1.3 血浆样品采集处理

大鼠经适应性饲养3 d，临用前禁食不禁水12 h，从眼眶静脉丛采集血液样品，肝素钠抗凝，4000 r/min离心10 min获得血浆，取50 μL血浆样品加入1 mL正己烷，2000 r/min振荡混匀10 min，离心后分取正己烷层950 μL，37℃加热氮气吹干，加入50 μL甲醇（含内标益智酮甲200 ng/ mL）复溶，2000 r/min振荡混匀3 min，13 000 r/ min离心10 min，取上清液置微量进样管中，待进样分析。

1.4 色谱-质谱条件

菲罗门Kinetex XB-C18色谱柱（2.10 mm×50 mm，2.6 μm），柱温40℃，以水（含0.01%甲酸，A）-甲醇（含0.01%甲酸，B）为流动相梯度洗脱［梯度洗脱程序：0～0.50 min（1%B），0.51～6.50 min（60%～100%B），6.51～8.00 min（1%B），流速0.30 mL/min，进样量10 μL］。电喷雾离子源（ESI），正离子检测，喷雾电压5500 V，GS1为55 psi，GS2为45 psi，帘气为35 psi，喷雾温度为500℃，碰撞气为 10 psi。多反应离子监测（MRM），用于定量分析的离子对为m/z 329.2→163.0，内标化合物益智酮甲为313.1→137.0。

1.5 专属性考察

取空白血浆、空白血浆加对照品和内标溶液、静脉注射给药后30 min血浆样品，按1.3项下样品处理方法处理，按1.4项下条件进样分析。

1.6 线性关系考察

取0.1 mg/mL DPHA甲醇溶液适量，用空白血浆配制成2000 ng/mL血浆样品，再用空白血浆逐级稀释成1000、100、10、5、2、1 ng/mL的血浆样品，经1.3项下方法处理后，进样10 μL，按1.4项下方法进行分析。

图1 5-羟基-7（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮

1.7 精密度和准确度考察

配制高、中、低3种浓度（1600、100、6 ng/mL）的DPHA血浆样品，每个浓度设5个平行样，经1.3项下方法处理后分别进样分析，计算日内精密度和准确度，连续测定3 d，计算日间精密度。

1.8 基质效应和提取回收率试验

按文献方法[13-14]，采用提取后添加法评定基质效应，同时考察提取回收率。Set1：取高、中、低3种浓度DPHA对照品溶液50 μL，直接进样分析，得到峰面积A1；Set2：取空白血浆50 μL，经2.3项下方法处理至氮气37℃加热吹干步骤，然后分别加入高、中、低3种浓度DPHA对照品溶液50 μL复溶，2000 r/min振荡混匀3 min,13 000 r/min离心10 min，取上清液进样分析，得到峰面积A2；Set3：配制高、中、低3种浓度DPHA血浆样品，各取50 μL经1.3项下方法处理后进样分析，得到峰面积A3。以上每个浓度设5个平行样。基质效应ME=A2/A1×100%；提取回收率RE=A3/A2× 100%。

1.9 稳定性考察

配制高、中、低3种浓度的DPHA血浆样品，每个浓度设5个平行样，考察血浆样品在室温放置4 h、冻融循环3次和血浆样品处理后置自动进样器中8 h的稳定性，经1.3项下方法处理后分别进样分析，计算样品短期稳定性。

2 结果

2.1 专属性考察结果

DPHA、益智酮甲出峰时间分别为3.91、4.90 min，分离度大于1.5，空白溶剂和基质对测定无干扰。色谱图见图2。

图2 DPHA（1）和内标益智酮甲（2）色谱图A：空白血浆；B：空白血浆加DPHA；C：空白血浆加内标；D：空白血浆加DPHA和内标；E：静脉注射给药30 min后血浆样品

2.2 线性考察结果

以待测物与内标峰面积之比（y）为纵坐标、待测物浓度（x）为横坐标、权重为1/x进行线性回归，得回归方程y=0.00119x+0.000409（r=0.9996），表明DPHA为1～2000 ng/mL时线性关系良好。

2.3 精密度和准确度考察结果

研究结果（表1）显示，日内、日间精密度RSD均低于15%，重复性良好；准确度为105.03%～112.80%。

表1 DPHA定量分析精密度和准确度结果

2.4 基质效应和提取回收率试验结果

结果（表2）表明，高、中、低3种浓度下，待测物均无显著的基质效应，提取回收率大于70%。

表2 大鼠血浆中DPHA的基质效应和提取回收率（n=5）

2.5 稳定性考察结果

各浓度样品测试的准确度为 102.46%～110.60%，小于15%；3种处理方式对样品稳定性无明显影响。结果见表3。

表3 血浆样品中DPHA的稳定性

2.6 样品测试

将上述分析方法用于分析大鼠给药后血浆样品。取4只SD大鼠，尾静脉注射给予DPHA 1.0 mg/kg，0.5 h后经眼眶静脉取血，按1.3项下方法处理后分别进样分析，计算得血药浓度为36.2±5.1 ng/mL（n=4，RSD=14.0%）。

3 讨论

DPHA结构与姜黄素类似，一般而言姜黄素类似物溶解性、稳定性较差，应用液相色谱-质谱联用技术分析这些化合物在血浆中的含量，文献报道基质效应为43%～86%，对结果的准确性存在一定影响[14-15]。本研究建立的DPHA液相色谱-质谱分析方法，基质效应为99.63%～110.50%，方法的建立过程中，还考察优化了离子源喷雾电压、GS1、GS2、帘气、喷雾温度等参数。对血浆样品的处理，通过试验对比了甲醇、乙腈沉淀和乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚萃取，最后确定正己烷萃取处理后检测干扰少、提取率高。同时设定了3对 离 子 对（329.2→163.0、329.2→137.0、392.2→311.0）检测分析DPHA，其中392.2→311.0信号最强，但干扰峰较多，最后选择信号稍弱而干扰较少的329.2→163.0作为定量分析的离子对。以上结果为DPHA的药代动力学研究奠定了基础，也为相关药效药理研究的给药剂量提供了参考。

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