一株产耐高温β-甘露聚糖酶菌株的筛选鉴定

罗长财，缪静，李国莹，杜瑶，余晓斌

1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；

2.鲁东大学 生命科学学院，山东 烟台 264025

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）广泛存在于动物、植物及微生物中，是一种能降解β-1，4-甘露糖苷键的水解酶，可应用于饲料、食品加工、生物能源、纺织、造纸、石油开采等领域[1-2]。

采用微生物生产β-甘露聚糖酶，具有表达量高、易于工业化发酵生产及后处理、生产成本相对低廉等特点，因而成为β-甘露聚糖酶工业化生产的主要方式[3]。目前已有来源于黑曲霉（Asper⁃gillus niger）[4]、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）[5]、费氏新萨托菌（Neosartorya fischeri）[6]、硫色曲霉（A.sulphureus）[7]、热杆梭菌（Clostridium thermocel⁃lum）[8]等菌种的β-甘露聚糖酶获得表达及应用。

β-甘露聚糖酶在工业化应用时，经常会涉及到高温处理过程，而导致酶失活。因此，为满足各种工业应用要求，提高β-甘露聚糖酶的耐高温性能一直是急需解决的问题。

近年来，一些极端环境下生长的微生物被分离、筛选出来，如从海底火山口的硫磺矿区分离出来的极端铁代谢嗜热菌Pyrodictium abyssi，可在80～110℃范围内生长[9]。这些可耐受极端环境的微生物蕴藏着丰富的酶基因资源[10]，因此，寻找产β-甘露聚糖酶的嗜热菌，就成为开发耐高温β-甘露聚糖酶的有效途径。

我们从热泉（水温高于68℃）中分离、筛选出一株产β-甘露聚糖酶的极端嗜热细菌。在本研究中，我们采用多种方法鉴定出该菌为一种极端嗜热的枯草芽胞杆菌。另外，通过对该菌所产β-甘露聚糖酶进行测试，发现其耐高温性能良好。

1 材料与方法

1.1 材料

槐豆胶（G0573）购自Sigma-Aldrich公司；酵母粉、胰蛋白胨购自Oxoid公司；魔芋精粉购自湖北强森魔芋科技有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。

富集培养基：胰蛋白胨1.5 g/L，酵母粉1 g/ L，氯化钠1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KCl 0.5 g/ L，KH2PO40.5 g/L，FeCl31 g/L，CaCl20.23 g/L，（NH4）2SO41 g/L，pH7.0。

LB琼脂筛选固体培养基[11]：胰蛋白胨10 g/ L，酶母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，槐豆胶6 g/L，刚果红5 g/L，琼脂粉20 g/L。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酶母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20 g/L（LB液体培养基不含琼脂）。

发酵培养基：磨芋精粉20 g/L，（NH4）2SO410 g/L，NaNO35 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，KH2PO41.5 g/L。

恒温恒湿培养箱、恒温摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；紫外-可见光分光光度计（岛津公司）；梯度PCR扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；精密pH计（上海雷磁仪器厂）。

1.2 菌体富集培养及筛选

将取自热泉（位于江西省抚州市境内，水温高于68℃）出水口处的水样及泥沙样本于无菌条件下分别接入富集培养基中，60℃、200 r/min培养24 h，取培养物涂布LB琼脂筛选固体培养基，于42℃培养箱中静置培养48 h。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 形态观察 将筛选出的单菌落于LB固体培养基上划线培养，培养2 d后观察菌落特征，并送江南大学分析测试中心进行电镜检测。

1.3.2 生理生化培养鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]及《微生物学实验手册》[13]中的鉴定方法，对筛选出的产β-甘露聚糖酶菌种进行生理生化检测，初步完成菌种鉴定。

1.3.3 16S rDNA鉴定 采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，提取所筛选菌株的基因组DNA，利用通用引物27F（AGAGTTTGATCCTCGC TCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增（94℃预变性3 min；94℃变性60 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸10 min），获得目标菌株的16S rDNA。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，送上海生工公司测序，所测定的16S rDNA序列通过NCBI进行比对，寻找同源性高的序列，再利用MEGA5.2软件绘制出该菌株的系统发育树。

1.4 菌体在不同温度、pH值下的生长测试

在30～85℃及不同pH值条件下，分别采用LB液体培养基以200 r/min培养24 h，8000×g离心10 min，菌体于120℃烘干至恒重，检测不同条件下的菌体生长量。根据菌体量以确定该菌株在不同条件下的生长状况。

1.5 菌株发酵及酶液制备

分离、筛选获得的菌株在500 mL三角瓶中进行发酵产酶培养，初始装液量为100 mL，初始pH7.0，温度50℃，转速200 r/min，发酵36 h。发酵结束后，8000×g下离心10 min，对上清液进行后续检测。将该菌株所产的β-甘露聚糖酶命名为BS-Man。

1.6 甘露聚糖酶活力测定

1.6.1 测定方法 采用DNS法检测β-甘露聚糖酶酶活。用0.1 mol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释酶液及配制反应底物（6 g/L槐豆胶），吸取2.0 mL经37℃预热的待测酶液至试管中，加入2.0 mL经37℃预热的底物溶液，振荡，37℃精确水浴30 min，然后加入5.0 mL DNS试剂，振荡混匀，以终止酶解反应。整个反应体系在沸水中加热5 min后，用自来水冷却至室温，加水定容至25.0 mL，振荡混匀。以标准空白样作为空白对照，测定D540nm值，通过标准曲线计算相应的酶活。1.6.2 酶活定义 在37℃、pH5.5的条件下，每分钟从3 mg/mL甘露聚糖溶液中水解释放1 μmol还原糖所需酶量为一个酶活单位（U）。

1.7 BS-Man的最适反应pH值

分别添加等量的BS-Man酶液，在37℃、不同pH值（1.5～10）条件下反应30 min（pH1.5～5.0：磷酸氢二钠-盐酸缓冲液；pH5.0～8.5：磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；pH8.5～10.0：甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），测定不同pH值下的酶活性，以所测得最高酶活性为100%，其余不同pH值条件下所测酶活力与之相比，得到该酶在不同pH值下的相对酶活，从而确定其最适pH值。

1.8 BS-Man的最适反应温度及耐热性能测试

在最适pH值条件下，于不同温度（30～80℃）反应30 min，设定最高酶活为100%，其余反应温度下所测出的酶活力与之相对比，获得各反应温度下的相对酶活，以确定该酶的最适反应温度。

另外，为确定该酶的耐高温性能，在相同条件下，各组取等量酶液在不同温度（60～90℃）预处理不同时间，以未经热处理的酶液酶活力为100%，各处理组与之相比，获得该酶经不同温度处理后的剩余相对酶活，确定其耐高温性能。

2 结果

2.1 产β-甘露聚糖酶的菌株筛选

对富集培养后的培养产物，采用添加魔芋精粉及刚果红的LB固体筛选培养基进行菌种筛选，结果如图1，在LB固体培养基上生长出的菌落呈白色，表面粗糙不规则，有隆起、皱褶。所挑选菌落的水解透明圈与菌落大小见表1，根据H/C比值，选取2号菌落进行后续鉴定，并将该菌株命名为TBS2。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态观察 TBS2在电镜下的形态见图2，该菌呈杆状，可见内生孢子，无荚膜，长有鞭毛，符合芽孢杆菌的形态特征。

2.2.2 生理生化鉴定 TBS2的生理生化测试结果见表2，参照鉴定手册，可以初步判定TBS2为芽胞杆菌属菌株。

图1 产β-甘露聚糖酶生产菌株筛选

图2 TBS2在电镜下的形态（10 000×）

表1 各菌落水解透明圈与菌落直径

2.2.3 16S rDNA鉴定 以提取的TBS2基因组DNA为模板、27F和1492R为引物进行PCR扩增，获

得一条约1.5 kb的条带（图3），测序结果表明该序列总长为1503 bp。在NCBI数据库中进行BLAST比对，选取相似序列，采用MEGA5.2构建菌株的系统发育树如图4。可以看出，TBS2与枯草芽孢杆菌位于同一分支，同源性最高，达到99%。因此，结合以上菌体形态、生理生化特征，可以确定我们从热泉中分离、筛选获得的微生物为一种嗜热枯草芽孢杆菌。

2.3 TBS2在不同温度及pH值条件下的生长性能

图3 TBS2的16S rDNA PCR产物分析M：DNA marker；1：PCR扩增产物

图4 TBS2系统发育进化树

表2 TBS2生理生化特征

将筛选出的嗜热枯草芽胞杆菌TBS2，在不同温度及pH值条件下，于LB液体培养基中进行生长培养。结果表明，TBS2可在35～80℃下生长，温度低于35℃及高于85℃时均不生长，最适生长温度为50℃。此外，该菌株可在pH4.0～9.0范围内生长，最适生长pH值为6.0～7.0，该结果与段蕾等报道的枯草芽孢杆菌CD-3一致[14]。

2.4 BS-Man的最适pH值测定

由TBS2所产β-甘露聚糖酶BS-Man的反应pH值曲线（图5）可以看出，BS-Man的最适反应pH值为6.0。

2.5 BS-Man的最适反应温度及耐热性能

由BS-Man的反应温度曲线（图6）可以看出，BS-Man的最适反应温度为55℃。

BS-Man的耐热性能曲线如图7，在60～70℃处理不超过60 min时，酶活损失量很小，但随着处理温度及时间的增加，酶活损失加剧，但即使这样，该酶在 90℃处理 10 min，剩余酶活仍达63.6%，这表明我们筛选出的菌株所产β-甘露聚糖酶具有良好的耐高温性能。

3 讨论

图5 BS-Man的反应pH值曲线

图6 BS-Man的反应温度曲线

图7 BS-Man在不同温度下的耐热性能

β-甘露聚糖酶应用广泛，但在很多领域内应用时须具有良好的耐高温能力。如饲料制粒时，通常要求在85℃以上处理3 min左右，一般的酶在这种条件下极易完全变性，从而失去效果。因此，作为一种合格的饲料用酶，要求所开发的β-甘露聚糖酶至少能耐受85℃以上的高温。

目前已开发出的β-甘露聚糖酶的耐高温性能普遍不高，难以满足现有工农业生产需求，因此，开发出一种具有优良耐高温性能的β-甘露聚糖酶具有良好的市场应用前景。

为提高β-甘露聚糖酶的耐高温性能，有人尝试过采用定点突变、添加保护剂或在酶蛋白表面进行物理包被等方法，以改变酶蛋白的空间结构，或避免酶蛋白与热气直接接触来提高其耐高温性能[15-16]，但所取得的效果并不理想。

极端环境下生长的微生物，如极端嗜热、极端嗜盐等微生物，往往有极强的耐受能力，具有优异而特殊的基因资源。因此，这些微生物成为目前生物资源开发的一大宝库。至2001年，已有60多种极端微生物被发现并利用[17]。通常，极端嗜热的微生物所产生的酶往往具有极高的热稳定性、pH值稳定性和耐受化学或物理变性剂的优良特性，如耐高温α-淀粉酶、DNA聚合酶等的开发即是非常有代表性的例子。因此，从环境中直接筛选极端嗜热微生物，通过分子生物学技术克隆相关基因，进一步进行相应的优化、改造，并选择合适的表达系统高效表达，是耐高温酶制剂开发的一个发展方向，更具有可行性和可操作性，可产生巨大的工业化生产、应用价值。

在本研究中，我们从热泉中分离、筛选出一株极端嗜热的枯草芽孢杆菌TBS2，该菌所产的耐高温β-甘露聚糖酶具有良好的耐高温性能，这为我们后续的重组耐高温β-甘露聚糖酶的开发及应用奠定了坚实的基础。

[1] Chauhan P S,Puri N,Sharma P,et al.Mannanases: microbial sources,production,properties and potential biotechnological applications[J].Appl Microbiol Biotech⁃nol,2012,93(5):1817-1830.

[2] Malherbe A R,Rose S H,Viljoen-Bloom M,et al. Expression and evaluation of enzymes required for the hydrolysis of galactomannan[J].J Ind Microbiol Bio⁃technol,2014,41(18):1201-1209.

[3] Luo H,Wang Y,Wang H,et al.A novel highly acid⁃ic beta-mannanase from the acidophilic fungus Bispo⁃ra sp.MEY-1:gene cloning and overexpression in Pi⁃chia pastoris[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,82(3): 453-461.

[4] Yu S,Li Z,Wang Y,et al.High-level expression and characterization of a thermophilic β-mannanase from Aspergillus niger in Pichia pastoris[J].Biotechnol Lett,2015,37(9):1853-1859.

[5] Vu T T,Quyen D T,Dao T T,et al.Cloning,highlevel expression,purification and properitie of a novel endo-beta-1,4-mannanase from Bacillus subtilis G1 in Pichia pastoris[J].J Microbiol Biotechnol,2012,22 (3):331-338.

[6] Yang H,Shi P,Lu H,et al.A thermophilic β-man⁃nanase from Neosartorya fischeri P1 with broad pH stabilityand significanthydrolysisability ofvarious mannan polymers[J].Food Chem,2015,173:283-289.

[7] Chen X L,Cao Y H,Ding W Q,et al.Cloning,func⁃tionalexpression and characterization ofAspergillus sulphureus β-mannanase in Pichia pastoris[J].J Bio⁃technol,2007,128(3):452-461.

[8] Ghosh A,Verma A K,Gautam S,et al.Structure and functional investigation of ligand binding by a family 35 carbohydrate binding module(CtCBM35)of β-man⁃nanase of family 26 glycoside hydrolase from clostridi⁃um thermocellum[J].Biochemistry(Moscow),2014,79(7): 672-686.

[9] Rieger G,Rachel R,Hermann R,et al.Ultrastructure of the hyperthermophilic archaeon Pyrodictium abyssi [J].J Struct Biol,1995,115:78-87.

[10]Leuschner C,Antranikian G.Heatstable enzymes from extremely thermophilic and hyperthermophilic microor⁃ganisms[J].World J Microbiol Biotechnol,1995,11(1): 95-114.

[11]Downie B,Hilhorst H W M,Bewley J D.A new as⁃say for quantifying endo-β-D-mannanase activity us⁃ing congored dye[J].Phytochemistry,1994,36(4):829-835．

[12]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[13]周德庆.微生物实验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1986.

[14]段蕾,高润池,许波,等.β-甘露聚糖酶产生菌的分离·鉴定及酶学特性研究[J].安徽农业科学,2008,36(24): 10311-10314.

[15]Zhou Haiyan,Yang Wenjiao,Tian Yun,et al.N-termi⁃nal truncation contributed to increasing thermal stabili⁃ty of mannanase Man1312 without activity loss[J].J Sci Food Agric,2016,96(4):1390-1395.

[16]刘朝辉,武伟娜,刘跃,等.保护剂提高β-甘露聚糖酶热稳定性的研究[J].天津大学学报,2008,41(1):114-118.

[17]唐雪明,王正祥,诸葛健.具有工业应用价值的高热稳定性极端酶[J].食品与发酵工业,2001,27(5):65-70.