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Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

2018-04-09耿介王超男李少华丁红梅李慧黄皑雪李洁李达白琛俊张坦董洁邵宁生

生物技术通讯 2018年2期
关键词:单克隆细胞株抗性

耿介,王超男,李少华,丁红梅,李慧,黄皑雪,李洁,李达,白琛俊,张坦,董洁,邵宁生

军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所,北京 100850

人vasorin(VASN)蛋白又称slit-like2(SLITL2)蛋白,是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,其N端胞外结构域可以被去整合素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloprotease 17,ADAM17)酶解为可溶性VASN(soluble VASN,sVASN),释放至体液中[1]。已有文献报道,人VASN蛋白在主动脉的血管平滑肌细胞有较高水平的表达,在肾脏、胎盘组织也有表达,并且在乳腺癌细胞、肝癌组织及细胞中也有高表达[2]。

关于VASN蛋白的生物学功能已有报道,TGF-β能够与可溶性VASN蛋白结合,抑制TGF-β介导的上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchy⁃mal transition,EMT),提示VASN蛋白可能参与了肿瘤的发生发展[3]。而我们实验室的前期工作提示VASN蛋白可能是潜在的肝癌血清标志物[4],并且对VASN蛋白的生物学功能进行了初步探讨。细胞中VASN蛋白有促进肝癌细胞增殖和迁移的作用[4];而VASN蛋白存在于HepG2细胞来源的外泌体中,其可被转运至人脐静脉内皮细胞(hu⁃man umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中,对HUVEC的迁移也有促进作用[5]。基于以上结果,深入探讨VASN蛋白的生物学功能及其分子机制,对于研究肿瘤的发生机制非常有意义。因此,我们拟构建VASN基因稳定敲除的细胞株,为深入研究VASN蛋白的生物学功能奠定基础。

我们利用基因编辑技术CRISPR/Cas9,将潮霉素B的抗性基因插入VASN基因,从而破坏了VASN的读框,使VASN蛋白的表达发生异常;然后再利用潮霉素B抗性筛选获得稳定敲除VASN的HepG2细胞株;进而,利用稳定敲除VASN的HepG2细胞株研究VASN的生物学功能和分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2细胞由本室保存;表达载体pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro由军事医学研究院郑晓飞教授惠赠;pBackZero-T载体、平末端PCR产物加A试剂盒购自TaKaRa公司;pfu酶购自北京全式金生物技术公司;感受态大肠杆菌DH5α、T4DNA连接酶、柱式基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司;限制性核酸内切酶BamHⅠ、BsmBⅠ购自Thermo Scientific公司;PRIME jet转染试剂购自PolyPlus公司;潮霉素B购自罗氏公司;VASN抗体由本室自行制备;引物由生工生物技术公司合成;CCK-8购自碧云天生物技术有限公司;2×SYBR PCR Mix(ROX)购自康为公司;TRIzol试剂购自Sigma公司。

1.2 构建pCas-gRNA质粒

运用Crispr Design程序(http://crispr.mit.edu/)设计针对VASN基因序列的指导 RNA(guide RNA,gRNA)的3对引物序列(表1),送生工公司合成。gRNA引物退火,用BamHⅠ和BsmBⅠ双酶切,将酶切的退火产物与具有相同粘性末端的载体pCas-guide连接,20℃连接4 h,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于含氨苄西林的LB培养板上于37℃过夜培养,挑取细菌单克隆PCR鉴定,分别选取2个阳性克隆测序。

1.3 构建供体DNA质粒pBackZero-T-VASN

收集HepG2细胞,按照基因组提取试剂盒说明书提取HepG2细胞基因组;以提取的细胞基因组作为PCR模板,分别以VASN-LF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR为引物,扩增VASN左、右同?源臂片段VASN-L和VASN-R;以Hy-F/Hy-R为引物,质粒pSilencer2.1-U6hygro为模板,扩增潮霉素B抗性基因片段Hy;将片段VASN-L、Hy和VASNR混合作为模板,以VASN-LF和VASN-RR为引物进行重叠PCR,扩增目的片段VASN-KO;用平末端PCR产物加A将单个碱基A加在VASN-KO片段末端,进而与pBackZero-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,挑取细菌单克隆PCR鉴定,选取4个阳性克隆测序。

表1 合成的引物序列

1.4 细胞转染及VASN稳定敲除细胞株筛选

将HepG2细胞以1×105/mL接种于6孔细胞板中,当细胞生长至约40%时转染1 μg pCasgRNA质粒,48 h后再转染1.5 μg pBackZero-TVASN质粒;约5 d后,将转染后的HepG2细胞以6×104/mL的密度接种到100 mm2细胞培养皿中,待细胞完全贴壁后加入潮霉素B(300 μg/mL)进行抗性筛选,2~3 d换液一次;培养至第10 d在显微镜下观察细胞培养皿,可以看到已有单克隆形成,将其转移至6孔板中继续扩大培养。

无限稀释法筛选VASN稳定敲除的HepG2单克隆细胞株。胰酶消化细胞,以新鲜培养基稀释细胞浓度为10/mL,将稀释的细胞悬液接种至96孔板,100 μL/孔,培养1周后显微镜下观察,选取单克隆细胞扩大培养,扩大培养至24孔板时,培养基中加入300 μg/mL潮霉素B继续培养。

1.5 Western印迹检测VASN敲除细胞株中的VASN蛋白含量

用含潮霉素B的培养基培养1周,收集细胞,提取细胞总蛋白,BCA法定量蛋白,每泳道40 μg蛋白进行SDS-PAGE,Western印迹鉴定,一抗为本室自制的鼠源VASN抗体(终浓度1 μg/mL),4℃孵育整夜,二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG,室温孵育约1 h,ECL显影。

1.6 RT-PCR检测VASN敲除细胞株中VASN mRNA水平

用含潮霉素B的培养基培养1周,收集细胞,TRIzol提取细胞总RNA,取1 μg RNA,以Oligo dT为引物,用反转录酶将RNA反转成cDNA。20 μL体系中,以1 μL cDNA为模板,VASN-F/ VASN-R为引物进行RT-PCR实验,检测VASNmRNA表达水平。

1.7 细胞增殖实验

细胞生长曲线可以直观地反映细胞的增殖能力。胰酶消化对数生长期的VASN稳定敲除的细胞和野生型HepG2细胞,用新鲜培养基将细胞稀释至104/mL,按100 μL/孔种于96孔板。细胞贴壁时记为零点,分别在0、24、48、72、96 h时加入10 μL CCK-8试剂,细胞培养箱中孵育1.5 h,测定不同时间点的D450nm值,绘制细胞生长曲线。

1.8 Tranwell细胞迁移实验

将VASN稳定敲除的HepG2细胞和野生型HepG2细胞培养至对数生长期,胰酶消化,收集细胞,用新鲜培养基重悬细胞至2×105/mL;取200 μL细胞悬液种于Transwell小室的上层,小室下层加入500 μL新鲜培养基,细胞培养箱中培养12 h;用棉签擦去Transwell小室上层内侧细胞,用0.1%结晶紫染色,室温放置30 min;将多余的结晶紫冲洗干净,显微镜下观察细胞迁移情况并拍照;用30%的醋酸酒精洗脱穿膜的细胞,测定D450nm值。

1.9 统计学方法

用SAS软件分析数据,采用Student'st检验进行统计学分析,P<0.05视为具有统计学差异。

2 结果

2.1 构建pCas-gRNA质粒

用Crispr Design程序设计gRNA,将靶位点序列设定在VASN编码基因起始位点后200~400 bp。为了降低脱靶的可能,共选取了3条gRNA序列。将合成的3对DNA片段分别退火形成双链,进而双酶切,然后与具有相同粘性末端的pCAS-guide载体连接,获得重组质粒pCAS-gRNA。重组子分别转化感受态细胞,LB平板培养,氨苄西林抗性筛选,挑取单克隆进行菌落PCR,鉴定为阳性的克隆测序(图1),结果表明3个pCAS-gRNA质粒均构建成功。

2.2 构建供体DNA质粒pBackZero-T-VASN

以HepG2细胞基因组为模板,分别以VASNLF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR为引物,扩增VASN左、右同源臂片段VASN-L和VASN-R;以Hy-F/Hy-R为引物,质粒pSilencer2.1-U6hygro为模板,扩增潮霉素B抗性基因片段Hy(约1100 bp)(图2A)。将片段VASN-L、Hy和VASN-R混合作为模板,以VASN-LF和VASN-RR为引物扩增VASN同源臂供体DNA片段VASN-KO(图2B)。将单个碱基A添加在VASN-KO片段末端,进而与pBackZero-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌落PCR鉴定为阳性的克隆测序(图3)。序列比对结果显示,同源臂供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功。

图3 菌液PCR鉴定阳性克隆M:DNA marker DL2000;1~8:单克隆;NC:阴性对照;PC:阳性对照

2.3 基因组水平鉴定转染细胞株

将pCas-gRNA与pBackZero-T-VASN共转染HepG2细胞,基因组发生同源重组,潮霉素B抗性基因插入VASN基因的特定位点,使VASN不能正确表达。提取转染的细胞基因组DNA,以KO-F/ KO-R为引物进行PCR鉴定。结果显示2个重组质粒转染的细胞基因组DNA经PCR扩增后在750 bp处出现目的条带,而野生型HepG2细胞则无条带,证明潮霉素B抗性基因正确插入VASN基因的特定位点(图4),VASN读框已被破坏,VASN蛋白不能表达。

图4 基因组PCR鉴定M:DNA marker DL5000;NC:阴性对照;1、3、4:插入潮霉素B基因后片段

2.4 Western印迹鉴定VASN稳定敲除的单克隆细胞株

用无限稀释法筛选VASN敲除的细胞单克隆,培养约1周后显微镜下观察,将含有单克隆细胞的孔继续培养,并加入潮霉素进行抗性筛选。当细胞数量足够时,取出部分细胞提取总蛋白,Western免疫印迹鉴定,结果显示1~5号克隆的VASN蛋白表达水平均明显下调,1、4号最为显著(图5)。

2.5 RT-PCR鉴定VASN稳定敲除的单克隆细胞株

经过Western印迹鉴定,1号(1#)和4号(4#)VASN稳定敲除细胞中的VASN蛋白含量最低,因此将筛选出的1#、4#细胞做基因水平鉴定。收集细胞提取总RNA,反转录为cDNA,qPCR鉴定其VASNmRNA表达。1#细胞的VASNmRNA表达水平最低,只有野生型HepG2细胞(WT)的1/7(图6),统计学分析表明二者有明显差异,说明1#单克隆细胞中的VASN基因被基本敲除。

图5 Western印迹检测单克隆细胞株中VASN的表达

图6 RT-PCR鉴定VASN的mRAN水平WT为野生型HepG2细胞,1#、4#为VASN稳定敲除细胞

2.6 VASN稳定敲除的细胞株增殖能力下降

为了验证VASN蛋白对细胞增殖能力的影响,利用CCK-8法检测VASN敲除细胞和野生型细胞的增殖情况。将筛选出的1#VASN敲除细胞和野生型细胞培养至对数生长期,以1000/孔的浓度种于96孔板,贴壁后分别于0、24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8,37℃孵育1.5 h后测定D450nm值,得到细胞生长曲线(图7)。可以看出野生型HepG2细胞的生长速度明显高于VASN敲除细胞株,并且两者的差距随着时间的延长逐渐增大(P<0.05)。此结果提示VASN蛋白可能参与细胞增殖过程。

图7 细胞生长曲线WT为野生型HepG2细胞,1#为VASN稳定敲除细胞

2.7 VASN稳定敲除的细胞株迁移能力下降

细胞迁移是反应细胞运动能力的重要指标,而且与侵袭和转移能力密切相关。我们利用Transwell实验检测了1#VASN敲除细胞和野生型HepG2细胞的迁移能力。结果显示,VASN敲除的细胞在膜上的覆盖面积明显小于野生型HepG2细胞(图8)。将穿过小室的细胞用30%醋酸洗脱,酶联仪测定D450nm值(图9),野生型HepG2细胞穿膜的细胞数约为VASN敲除细胞的2倍,VASN敲除细胞的迁移能力明显减弱(P<0.05)。此结果提示VASN可能参与细胞的迁移过程。

图8 结晶紫染色观察细胞迁移(400×)A:野生型HepG2细胞;B:1#VASN稳定敲除细胞

图9 穿过Transwell小室的细胞吸光度A:野生型HepG2细胞;B:1#VASN稳定敲除细胞

3 讨论

自2004年Yuichi Ikeda等首次鉴定出VASN蛋白,迄今相关研究较少。已有报道显示,VASN蛋白可能与机体发育、血管损伤修复及肿瘤的发生发展相关。我们的前期工作表明,VASN不仅可能是一种新型的肝癌血清标志物,而且可能在肝癌的发生发展中具有重要作用[3]。

CRISPR/Cas9是新兴的基因编辑技术[6],具有构建简单、剪切高效的特点[7]。向导RNA通过碱基互补配对,精确靶向目的基因序列,募集Cas9核酸内切酶到达目的基因,剪切基因组DNA。细胞通过2种修复机制,即同源重组修复和非同源末端连接修复,修复断裂的双链DNA[8-9],本研究采用了精确度相对高的同源重组修复策略[10],并且在提供同源重组所需的同源臂的同时,将潮霉素B抗性基因及终止子插入VASN基因起始位点下游,破坏VASN基因的开放读框,VASN蛋白不能正常表达,而抗性基因的表达为后续细胞筛选提供了便利。

在建立VASN稳定敲除HepG2细胞株后,我们开展了VASN蛋白生物学功能的初步探索和验证。利用CCK-8法和Transwell实验分别对比分析了VASN稳定敲除细胞株和野生型HepG2细胞间在增殖和迁移能力上的差异,结果显示缺失VASN蛋白可导致细胞增殖、迁移能力减弱,与已有研究结果相符,也进一步证明VASN缺失细胞株构建成功。这为深入阐释VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。

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