小鼠骨髓源性树突细胞和脾源性树突细胞的形态及生物学性能对比

张兰兰，闫军堂，刘　敏，胡京红，于　雪，范盎然，纪雯婷，任　虹，孙震宇

(北京中医药大学中医学院，北京 100029)

树突状细胞(DCs)是机体最重要的抗原提呈细胞，也是唯一能激活初始T细胞的抗原提呈细胞，是机体免疫的始动者，在免疫抑制和免疫耐受等方面发挥着重要作用。近年来人们已经能在体外应用MCM培养基诱导生成高纯度的DCs并已应用于肿瘤和过敏性疾病的治疗[1]，目前基于DCs的免疫治疗也被认为是最具前景的治疗方式[2]。一般来说DCs在体内分布较广，外周血、脾脏、脐带血、骨髓、皮肤等均有分布[3]，但大都含量极少且获得困难，如何获取纯度和性能较好的DCs用于更深入的DCs研究已经成为当前实验研究的重点[4]。近年来学者们对DCs体外培养进行了大量积极的探索，小则从培养手法、因子浓度等入手，大则结合现代生物技术如磁珠分选、流式分选等对其进行研究，DCs培养技术已日渐趋于成熟。相比于其他来源的DCs，骨髓来源的DCs因其培养方法简单、来源方便、含量较高等特点，成为应用较多的DCs研究来源，但1只小鼠的骨髓前体细胞经常规诱导后仅可生成(1～2)×107个DCs细胞，经分选后仅可获得前者数量的1/10[5]，远远不能满足当前实验对DCs的大量需求，故有必要对DCs进行更深入的探索。一直以来，脾源性DCs因其培养周期长、产量低等特点而较少应用于实验研究[6]，其确切的纯度、产量和性能目前尚不明确，基于目前DCs缺乏的现状，本课题组对脾源性DCs展开了研究。本研究通过在体外获得骨髓前体细胞和脾细胞，用GM-CSF和IL-4诱导生成DCs，结合流式细胞术(FCM)和酶联免疫吸附测定(ELISA)技术从两者的形态、细胞表面特异性分子表达、相关因子分泌等方面进行对比，以期明确脾源性DCs的性状和性能，为后期的实验研究筛选合适的细胞。

1　实验资料

1.1材料

1.1.1实验动物C57BL/6雌性小鼠，SPF级5周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK(京)2012-0001。实验小鼠均饲养在清洁级环境中统一喂养，取材时遵守人道主义原则，确保小鼠安乐死。

1.1.2主要试剂重组GM-CSF购于R&D(批号：404-ML-010)，重组IL-4因子购于R&D(批号：404-ML-010)，RPMI-1640购自美国Hy-clone公司(批号：11330032)，红细胞裂解液购于康为世纪，澳洲来源胎牛血清(FBS，批号：10099141)，双抗(批号：15140122)，PE标记的抗小鼠CD83单克隆抗体(货号：558205)及其同型对照(货号：554685)、APC标记的抗小鼠CD11c单克隆抗体(货号：554686)及其同型对照(货号：557400)均购于BD公司，LPS购于Sigma公司，IL-12 ELISA试剂盒(批号: LOT20170321002)购于武汉六合生物有限公司。

1.1.3主要仪器INCO2/108型CO2培养箱，Leica-DM2500 型显微图像系统，ePPendorf离心机(型号：5810)，Tecan酶标仪(型号：Safire2)，BD流式细胞仪。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓源性DCs的分离与培养处理C57BL/6小鼠脱颈椎处死，无菌条件下分离股骨与胫骨，用无菌纱布将组织剔除干净后用注射器将骨髓冲至培养皿中，收集到离心管中经离心后加入预温37 ℃的红细胞裂解液5 mL，静置5 min后加RPMI-1640 5 mL终止裂解，离心2次后计数，用完全培养基(含10 ng/mL 重组IL-4、20 ng/mL 重组GM-CSF、10%灭活的FBS及1%双抗)调整细胞浓度至1×106mL-1，将细胞种于6孔板，每孔2 mL于37 ℃、 5% CO2温箱中培养，3 h后弃去上清，加入相同因子浓度的完全培养基继续培养，48 h和96 h分别进行半换液处理，第8天部分细胞添加10 μg/mL LPS刺激DCs成熟。

1.2.2小鼠脾源性DCs的分离与培养处理C57BL/6小鼠脱颈椎处死，无菌条件下迅速取脾，研磨于1640培养基中，收集至离心管中经离心后加入预温37 ℃的红细胞裂解液5 mL，静置5 min后加RPMI-1640 5 mL终止裂解，离心2次后计数，用完全培养基(含10 ng/mL 重组IL-4、20 ng/mL 重组GM-CSF、10%灭活的FBS及1%双抗)调整细胞浓度至1×108mL-1，将细胞种于6孔板，每孔2 mL于37 ℃、 5% CO2温箱中培养，3 h后弃去上清，加入相同因子浓度的完全培养基继续培养，48 h和96 h分别进行半换液处理，第8天部分细胞添加10 μg/mL LPS刺激DCs成熟。

1.2.3倒置显微镜下细胞形态观察取培养第5，7，8天骨髓源性DCs和脾源性DCs于倒置显微镜下观察。

1.2.4扫面电镜下细胞形态观察收集培养第8天骨髓源性DCs和脾源性DCs，用3%戊二醛固定，用70%，90%，100%的乙醇进行梯度洗脱，乙酸异戊脂置换后，CO2临界点干燥，扫描电镜观察细胞表面结构。

1.2.5FCM检测收集培养第9天细胞，离心后用PBS重悬计数，取100 μL细胞量约为106的细胞于流式管中，分别加入APC标记的CD11c(小鼠DCs特异性表面标记物)抗体及同型对照抗体，PE-CD83及同型对照，室温避光孵育20 min，离心后流式细胞仪检测CD11c+及CD11c+CD83+的比例。

1.2.6ELISA检测收集细胞上清，按照试剂盒说明书检测IL-12含量。

2　结　　果

2.1倒置显微镜下DCs形态培养第5天时，骨髓源性DCs和脾源性DCs均有明显的毛刺状突起，悬浮于培养基中，不同的是脾源性DCs开始出现轻微聚集状态，而骨髓源性DCs大多呈散在状态，且底壁有明显的枝状巨噬细胞，见图1和图2。培养第7天时，骨髓源性DCs呈聚集状态，散在细胞较少，毛刺较之前变大，DCs缠绕在一起，见图3；脾源性DCs如葡萄状悬浮于培养基中，其集落大于骨髓源性DCs的集落，见图4。培养第8天时，骨髓源性DCs聚集状态变大，呈葡萄状悬浮于培养基中，细胞周边可见明显的毛刺状突起，见图5；脾源性DCs成簇状悬浮于培养基中，其集落较之前明显变大，而且明显大于骨髓源性DCs的集落，见图6。

图1　培养第5天时骨髓源性DCs形态(×200)

图2　培养第5天时脾源性DCs形态(×200)

图3培养第7天时骨髓源性DCs形态(×200)

图4　培养第7天时脾源性DCs形态(×200)

2.2扫描电镜下DCs形态培养第8天，骨髓源性DCs表面呈云雾状，周边可见明显的毛刺状突起，两个细胞紧紧聚集在一起，见图7；脾源性DCs表面呈薄纱状，周边可见丝状不定向突起或薄纱状圆球形突起，5个细胞紧紧缠绕在一起，其集落明显大于骨髓源性DCs集落，见图8。

图5　培养第8天时骨髓源性DCs形态(×200)

图6　培养第8天时脾源性DCs形态(×200)

图7　培养第8天时扫面电镜下骨髓源性DCs形态(×10 000)

图8　培养第8天时扫面电镜下脾源性DCs形态(×10 000)

2.3DCs纯度收集培养第8天的DCs流式鉴定其纯度，先圈出目标细胞，通过同型对照可得骨髓源性DCs纯度为(81.567±2.902)%，脾源性DCs 纯度为(87.227±4.463)%，脾源性DCs纯度高于骨髓源性DCs(t=1.841,P<0.05)。

2.4LPS刺激前后骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+表达情况LPS刺激前，骨髓源性DCs CD11c+CD83+表达比例明显高于脾源性DCs CD11c+CD83+表达比例(P<0.05)；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+表达比例均明显高于刺激前(P均<0.05)，脾源性DCs CD11c+CD83+表达比例与骨髓源性DCs比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1及图9、图10。

表1　LPS刺激前后骨髓源性和脾源性DCs CD11c+CD83+表达情况

图9　骨髓源性DCs LPS刺激前后CD11c+CD83+表达情况

图10　脾源性DCs LPS刺激前后CD11c+CD83+表达情况

2.5LPS刺激前后骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12情况LPS刺激前，骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12量比较差异无统计学意义(P>0.05)；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs分泌IL-12量均明显高于刺激前(P均<0.05)，脾源性DCs分泌IL-12量与骨髓源性DCs分泌量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3　讨　　论

DCs是Steinman和Cohn于1973年发现的一群外形奇特、具有强大的活化初始T细胞能力的细胞，它是免疫反应的启动者，具有很强的迁移能力。它起源于机体内的多功能造血干细胞，分为DCs前体细胞、未成熟DCs、成熟DCs 3个成长阶段，一般来说未成熟DCs可以通过其TLR直接感知病原体组分(如LPS)而诱导成熟，表现为膜表面共刺激分子上调[7]，分泌因子与趋化因子增加[8]，抗原提呈能力增强[9]，通过JAK/STAT通路使Th1、Th2细胞极化等[10]。研究发现LPS可通过提高iDC表面CD83、CD86的表达，分泌因子能力和刺激T细胞增殖能力的增强等来诱导iDCs的成熟[11]，成熟后的DCs可以更有效地发挥免疫调节作用[12]，但目前DCs尚无特定的表面分子标志及明确的生物学性能，需要结合细胞形态、生物学性能和表面特异性分子3个方面对DCs进行鉴别。

表2　LPS刺激前后骨髓源性和脾源性DCs分泌IL-12情况

人们已经能在体外用多种因子如GM-CSF、IL-4、IFN-α、Flt3配体、IL-10、IL-6、TPO和IL-13等诱导出纯度较高及性能较好的DCs[13],但DCs的产量仍不能满足当前DCs的实验需要。面对目前DCs短缺的问题，本课题组对脾源性DCs展开了探索。结果显示，经LPS诱导DCs成熟后，骨髓和脾脏均可获得有明显DCs生物学特性的细胞，纯度均为80%以上，且脾源性DCs纯度较高，形成的细胞集落也较大。FCM结果显示LPS刺激前骨髓源性DCs的CD11c+CD83+表达比例明显高于脾源性DCs 的CD11c+CD83+表达比例，CD83是DCs的表面特异性分子，一般来说低表达于未成熟DCs表面，高表达于成熟DCs表面，LPS是革兰阴性菌的组成部分，它可以与DCs表面的TLR4结合并通过MyD88依赖性途径或MyD88非依赖性途径活化NF-κB分子，继而介导诱导DCs的成熟[14]，结果说明骨髓源性DCs早于后者成熟，与文献[15]结果一致；LPS刺激后，骨髓源性DCs和脾源性DCs CD11c+CD83+的表达均增加，且脾源性DCs 的CD11c+CD83+表达比例与骨髓源性DCs比较差异无统计学意义，提示两者经LPS刺激后CD11c+CD83+表达情况相似。ELISA结果显示，骨髓源性DCs和脾源性DCs IL-12分泌量比较差异无统计学意义，提示两者分泌IL-12的性能相似；经LPS刺激后，两者分泌IL-12量均明显升高，可能是经LPS诱导后DCs的转录因子IRF-3和NF-κB被激活[16]，继而分泌更多的IL-12来更好地发挥免疫调节作用，且脾源性DCs 分泌IL-12量与骨髓源性DCs比较差异无统计学意义，两者DCs生物学特性相似。

实验过程中发现尚有很多问题有待解决：①在脾源性DCs培养3～5 d时镜下可见大量的暗色溶出物，笔者推测这部分溶出物可能是在因子选择下大量的非DCs前体细胞裂解死亡，但未进行深入研究。②关于骨髓前体细胞和脾细胞的种板密度仍需要探讨，笔者发现骨髓源性DCs生长后期密度过大，脾源性DCs生长后期密度过小。③由于时间原因,实验中笔者未对所培养细胞进行MLR(刺激T淋巴细胞增殖实验)和抗原吞噬能力检测，关于其特性尚需进一步研究。④脾源性DCs产量仅为骨髓源性DCs的1/7左右，但其纯度稍大于骨髓源性DCs，应当在脾源性DCs产量问题上进行深入研究，或许可以采取将脾源性DCs进行体外扩增再继续诱导培养的方法，但尚不能明确是否可行。

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