电针对面神经损伤兔面神经核中GDNF、CHAT表达的影响

童　威，何剑波，张文岐，晁　旭，陈谦谦

(1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2. 陕西省西安市西电集团医院，陕西 西安 710000；3. 陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000)

面神经损伤在临床中较常见，目前多认为与自主神经功能不稳、局部血液循环障碍、病毒感染等有关，多予以抗病毒、营养神经等治疗，严重者行外科手术，但部分患者效果不理想。近年研究显示，针灸治疗周围神经损伤有一定优势[1]，其中电针对面神经损伤疗效显著，能促进面神经损伤修复，使组织中神经生长因子表达增强[2-3]，但电针治疗促进面神经损伤修复的机制尚不清楚。本研究利用兔面神经损伤模型，观察了电针对面神经核中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、胆碱乙酰转移酶(CHAT)表达及神经元细胞形态的影响，旨在探讨电针对面神经损伤再生修复的作用机制。

1　实验资料

1.1实验动物新西兰健康家兔[西安交通大学医学部实验动物中心提供, 合格证号：SCXK(陕)2014-003]76只，雌雄各半，6～8月龄，体质量(2.5±0.25)kg，单笼普通颗粒饲料喂养。

1.2分组及造模将健康家兔随机分为假手术组、模型组、电针组、西药组，其中假手术组4只，余每组24只。除假手术组外，其余组均参照牙祖蒙[4]、姜国华等[5]动物模型制备方法制备面神经损伤模型：采用3%戊巴比妥钠1 mL/kg静脉麻醉家兔，左侧面部手术部位用脱毛剂脱毛、消毒，铺无菌孔巾，取耳屏前至下颌角下缘“S”形切口，钝性剥离皮肤、皮下组织，在腮腺筋膜表面向前剥开皮瓣，暴露面神经颊支，在距茎乳孔0.5 cm处(定位)用小号持针器钳夹面神经，满扣(压力约5 kg定量)时间为5 s(定时)，损伤面宽约1.5 mm，最后分层缝合肌肉、皮肤，饲养。假手术组麻醉后切开皮肤及钝性剥离面神经，不做钳夹，相同方法缝合。

1.3干预处理假手术组、模型组术后不给予干预；西药组造模后第1天开始给予维生素B110 mg、维生素B1250 μg加地塞米松2 mg肌肉注射，1次/d，地塞米松每7 d减半，连续4周；电针组造模后第1天开始进行电针治疗，每天连续治疗30 min，治疗5 d后休息2 d，疗程4周。电针腧穴定位参照中国针灸学会实验针灸分会制定的《动物针灸穴位图谱》、中国兽牧医学会编写的《中国兽医针灸学》及《实验针灸学》。翳风：乳突尖至下颌升支后缘垂线之中点，直刺1.0 cm；颧髎：外眦垂线和颧骨颞突下缘凹陷处，直刺垂直进针约2.0 cm；地仓：口角外侧1.0 cm，直刺0.5 cm；颊车：下颌角前上方咬肌最丰隆处中点，直刺0.5 cm；阳白：眶上缘中点上方约0.5 cm处，平刺进针约 1.5 cm；四白：眶下缘中点向下 0.5 cm 处，斜刺45°角进针约 2.0 cm；合谷：掌背侧第一、第二掌骨间，约第二掌骨中点桡侧，直刺0.2 cm。颊车与地仓连接；翳风与颧缪连接；阳白与四白连接；合谷：埋针，不予以电刺激。采用疏密波进行刺激，频率为18～20 Hz，电压1.5 V。

1.4样本采集分别于术后1，2，3，4周，每组随机取6只兔(假手术组每次1只)，用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉后,自领下至小腹行胸、腹联合切口，切断肋骨，剪断膈肌，暴露心脏。穿刺针头刺入左心室，用软静脉留置导管沿左心室经主动脉瓣插入主动脉，剪开左心耳，先用冰生理盐水250 mL快速冲洗组织内血液，待流出的液体清亮后，用4%多聚甲醛固定液快速推注约400 mL，取左侧脑干组织(面神经核位于脑桥下部靠近腹侧)。将所取标本迅速放入含有1∶1 000 DEPC的4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS固定液中固定，室温下经梯度乙醇脱水，石蜡包埋，以备切片。

1.5面神经核中神经元细胞形态观察与GDNF、CHAT检测切片HE染色后进行镜下观察。免疫组织化学法进行GDNF、CHAT检测，试剂盒均购自武汉博奥森公司,按试剂盒操作说明进行，以细胞浆内或核膜上出现棕黄色颗粒或斑片为阳性细胞，每兔取相同部位的切片，在10×40倍光镜下每张片取5个视野，在光镜下计数面神经核中GDNF、CHAT阳性表达细胞数。

2　结　　果

2.1各组面神经核中神经元细胞形态HE染色后，假手术组面神经核神经元胞体中细胞轮廓清晰，结构完整。模型组神经元细胞数目减少，细胞体积增大，细胞核浓缩、变形，部分细胞甚至出现核仁消失、变性坏死，可见点状或片状染色增加或减少, 出现圆形空泡，细胞轮廓模糊或消失。与模型组比较，电针组、西药组神经细胞轮廓结构清晰完整，肿胀、空泡数目减少，细胞数目增多。见图1～4。

图1　术后4周假手术组兔面神经元细胞形态(HE，×400)

图2　术后4周电针组兔面神经元细胞形态(HE，×400)

2.2各组兔面神经核中GDNF表达情况术后1周，4组间面神经核中GDNF表达情况比较差异无统计学意义(P均>0.05)；术后2，3，4周，模型组GDNF阳性表达细胞数均明显低于假手术组(P均<0.05)，且呈先下降后上升的趋势，术后3周阳性表达数最少，术后4周阳性表达数回升；电针组、西药组GDNF阳性表达数均明显高于模型组(P均<0.05)，且电针组明显高于西药组(P均<0.05)。见表1及图5～8。

图3　术后4周模型组兔面神经元细胞形态(HE，×400)

图4　术后4周西药组兔面神经元细胞形态(HE，×400)

表1　各组兔面神经核中GDNF表达情况个)

注：①与模型组比较，P<0.05；②与西药组比较，P<0.05。

图5　术后4周假手术组兔面神经核中GDNF表达情况(免疫组化，×400)

2.3各组兔面神经核中CHAT表达情况术后1，2,3,4周，模型组CHAT阳性表达数均明显低于假手术组(P均<0.05)，且呈先下降后上升的趋势，

图6　术后4周电针组兔面神经核中GDNF表达情况(免疫组化，×400)

图7　术后4周模型组兔面神经核中GDNF表达情况(免疫组化，×400)

图8　术后4周西药组兔面神经核中GDNF表达情况(免疫组化，×400)

术后2周阳性表达数最少；电针组、西药组CHAT阳性表达数随时间增加而增高，相邻两治疗阶段比较差异有统计学意义(P均<0.05)。电针组各时间段CHAT阳性表达数均明显高于模型组和西药组(P均<0.05)；术后1周，西药组CHAT阳性表达数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但术后2，3，4周均明显高于模型组(P均<0.05)。见表2及图9～12。

表2　各组兔面神经核中CHAT表达情况个)

注：①与模型组比较，P<0.05；②与西药组比较，P<0.05。

图9　术后4周假手术组兔面神经核CHAT表达情况(免疫组化，×400)

图10　术后4周电针组兔面神经核CHAT表达情况(免疫组化，×400)

图11　术后4周模型组兔面神经核CHAT表达情况(免疫组化，×400)

图12　术后4周西药组兔面神经核CHAT表达情况(免疫组化，×400)

3　讨　　论

中医对周围性面神经损伤的治疗有丰富的经验，其中针灸质量可促进气血循环，改善代谢，改善肢体痿软[6]。刘志丹等[7]综合大量的实践研究文献认为选用经穴治疗面神经损伤具有较好的疗效；刘佰成等[8]观察表明，运用针灸综合治疗周围性面瘫疗效明显优于单纯中药治疗；姜喜凤等[9]报道，运用普通针刺结合电针治疗周围性面瘫的效果明显优于单纯使用透针治疗；蒋小旭[10]运用电针治疗面神经炎取得良好效果。上述研究表明针灸治疗面神经损伤具有较好的疗效。本实验在现代科技的基础上，采用电针疏密波刺激地仓、颊车等具有通经活络、温经散寒作用的穴位，进一步观察了电针对面神经损伤的修复作用，结果显示，电针组神经细胞轮廓结构清晰完整，肿胀、空泡数目减少，细胞数目增多，证实电针治疗可修复面神经损伤。

GDNF可以保护多巴胺(DA)运动神经元，促进中枢运动神经元、外周运动神经元、感觉神经元、交感神经元等的存活和生长发育,在中枢神经系统生长发育、损伤修复等过程中发挥重要的神经营养作用，与帕金森病、脑缺血、神经性疼痛及癫痫等疾病密切相关[11]。 GDNF对面神经损伤的修复作用机制主要是通过与其受体结合发挥作用，GDNF受体系统主要是GDNF家族受体α(GFRα)和Ret蛋白组成的复合受体系统，一部分通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合位点锚定于细胞膜外表面的GFRα，另一部分通过跨膜的酪氨酸激酶Ret蛋白，信号得以传递。跨膜的Ret蛋白能够调节细胞的生长、分化[12]。GDNF与细胞表面的GFRα 结合形成GDNF-GFRα复合体后激活Ret受体，使细胞内Ret-Shc-Grb2蛋白复合体形成，而后Ret-Shc-Grb2蛋白复合体激活相关蛋白，从而引起一系列信号传导，发挥其生物学作用，促进神经元的损伤修复[13]。本实验结果显示，术后2，3，4周，模型组GDNF阳性表达细胞数均明显低于假手术组，且呈先下降后上升的趋势；电针组、西药组GDNF阳性表达数均明显高于模型组，且电针组明显高于西药组。提示电针刺激后，面神经核内GDNF表达升高，从而引起GDNF与其受体结合增加，两者结合可以促进神经系统生长发育、损伤修复等。

CHAT是一种在神经元胞体内合成的酶，当该转移酶被合成以后，通过轴质流动方式转移到神经轴突末端，其功能是将乙酰辅酶A转移到胆碱上，导致神经递质乙酰胆碱的形成。胆碱能系统参与多种神经功能的作用，一些胆碱能神经元的改变能导致神经系统疾病的发生，故CHAT通常被用来标记神经元功能状态。本实验结果显示，术后1，2,3,4周模型组CHAT阳性表达数均明显低于假手术组，且呈先下降后上升的趋势；电针组、西药组CHAT阳性表达数随时间增加而增高，且电针组各时间段CHAT阳性表达数均明显高于模型组和西药组。提示电针刺激可增加CHAT的表达，CHAT的增多有利于乙酰胆碱的形成，进一步促进胆碱能系统参与多种神经功能，有利于损伤面神经的再生修复。

综上所述，电针刺激可促进面神经损伤修复，其机制可能与增加面神经核中GDNF、CHAT的表达有关。

[参考文献]

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[2]章明星,刘阳阳，刘建卫，等. 电针治疗周围神经损伤的机制研究进展[J]. 辽宁中医杂志,2016,43(8):1769-1771

[3]牙祖蒙,王建华，李忠禹，等. 家兔面神经损伤后穴位针刺对神经生长因子及其受体表达的影响[J]. 中国中西医结合外科杂志,2000,6(4):234-236

[4]牙祖蒙. 穴位针刺对面神经再生影响的动物模型制作[J]. 实验动物科学与管理,1999,16(1):15-17

[5]姜国华,卫彦，单丽莉，等. 穴位电刺激对周围性面神经损伤兔面神经核中BDNF的影响[J]. 针灸临床杂志,2006,22(1):44-46

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[7]刘志丹,宋宣慧，唐艺丹，等. 对影响针灸治疗面瘫疗效若干环节问题的分析[J]. 针灸临床杂志,2016,32(2):88-93

[8]刘佰成,周基松. 针灸综合治疗周围性面瘫的疗效分析[J]. 大家健康,2016,10(11):107-108

[9]姜喜凤,王健，王军. 探讨针刺结合电针治疗周围性面瘫恢复期临床效果[J]. 中国卫生标准管理,2016,7(8):141-142

[10] 蒋小旭. 电针治疗面神经炎60例[J]. 广西中医药大学学报,2014,17(2):25-26

[11] 吴娜,董瑞国. 胶质细胞源性神经营养因子研究进展[J]. 徐州医学院学报,2010,30(7):487-489

[12] Forrest SL,Keast JR. Expression of receptors for glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands in sacral spinal cord reveals separate targets of pelvic afferent fibers [J]. J Comp Neurol，2008,506(6):989-1002

[13] Paratcha G,Ledda F. GDNF and GFRalpha:a versatile molecular complex for developing neurons [J]. Trends Neurosci,2008,31(8):384-391