线性探针技术检测结核分枝杆菌耐药性的效果分析

陈丽　秦玉宝　邬剑　唐鹭　林百丰　张学志

耐药结核病是我国目前结核病控制工作面临的主要挑战之一。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告结果显示，我国结核病耐多药率为6.8%[1]。世界卫生组织统计,2014年全球有48万例耐多药结核病患者，中国是耐多药结核病负担最严重的国家之一，全球约1/4的耐多药结核病患者来自中国[2-4]。快速、准确地进行耐药诊断对于治疗耐药结核病尤其是耐多药结核病、控制耐药结核病的传播极为关键。

线性探针技术是基于多重PCR原理，并将PCR扩增、反向杂交、膜显色技术合为一体的快速诊断药物耐药性的实验方法[5]。笔者选取2015年4月至2017年1月本实验室采用线性探针技术(GenoType®MTBDRplus)检测的结核分枝杆菌临床分离株的耐药性结果，与传统比例法药敏试验结果进行对比，分析线性探针技术的检测效果，以期为本地区推广使用线性探针技术提供参考依据。

资料和方法

一、菌株和试剂来源

1．菌株来源：2015年4月至2017年1月，黑龙江省结核病预防控制中心收到县(区)结核病防治机构报送的结核病患者痰标本387份，获取分枝杆菌阳性培养物分离株387株。经对硝基苯甲酸(PNB)固体培养法(简称“固体法”)菌种初筛和线性探针两种方法一致确认为NTM者8株，固体法菌种初筛结果为NTM而线性探针检测结果为MTB的1株，两种方法比较药敏试验结果时将此9例NTM去除；最终可供比较的MTB 临床分离株为378株，其中初治患者临床分离株334株、复治患者44株。

2．试剂：线性探针试验采用德国Hain Lifescience公司的GenoType®MTBDRplus检测试剂盒。比例法分枝杆菌药敏试验和PNB菌种初筛培养基采用珠海贝索生物技术公司商品化培养基。

二、实验方法

1.试剂和步骤：线性探针实验设备和试剂采用德国Hain Lifescience公司配套设备和GenoType®MTBDRplus试剂，试验方法按照GenoType®MTBDRplus 耐药检测试剂盒说明书进行。结果判读：每个探针试条共有27个反应条带，包含3个对照条带和24个探针条带，见图1。每个有效的结核分枝杆菌复合群测试其试条的对照条带均应显色，分别是标记物质控(CC)、扩增质控(AC)、结核分枝杆菌复合群。野生型菌株试条模式为野生型探针(WT)均显色，突变探针(MT)均不显色。WT包含各自基因最重要的耐药区。如果至少有一个野生型探针信号缺失(不显色)，则表示试验菌株对相应的抗生素耐药。MT检测一些能够引起耐药最常见的突变，每个与野生型模式不同的带型表示试验菌株耐药。用rpoB探针获得的带型可以得出试验菌株对RFP耐药结论；用katG探针获得的带型可以得出试验菌株对INH高水平耐药的结论，用inhA探针获得的带型可以得出试验菌株对INH低水平耐药的结论。

图1　线性探针试条的27个反应条带图

2.药敏试验方法：分枝杆菌菌种初筛参照《结核病诊断实验室检验规程》[6]的规定选用PNB固体培养基生长试验法。比例法分枝杆菌药敏试验参照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》[7]，使用2～3周菌龄的新鲜菌株，研磨比浊，倍比稀释为10-2和10-4浓度，分别接种在比例法药敏试验培养基上，4周后报告结果。

3.质量控制：经国家结核病参比实验室分枝杆菌药敏试验熟练度测试和分子生物学药敏试验诊断并进行质量控制，本实验室每年均达到质量控制要求。

4.相关定义：(1)敏感度指真耐药率，即试验对象被判断为耐药的概率，计算公式为：真耐药株数/(真耐药株数+假敏感株数)×100%。(2)特异度指真敏感率，即试验对象被判断为敏感的概率，计算公式为：真敏感株数/(真敏感株数+假耐药株数)×100%。

三、统计学分析

用SPSS 13.0软件进行统计学处理。率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义；一致性比较采用Kappa检验，Kappa≥0.75表示两者一致性较好。

结　　果

从获得分枝杆菌分离株至报告耐药性结果，比例法药敏试验所用的时间为32～60 d(包括重复试验的时间)，平均报告时间为42 d；GenoType®MTBDRplus 线性探针试验所用的时间为6～36 h(包括重复试验的时间)，平均报告时间为18 h。

一、两种方法检测378株MTB临床分离株对RFP和INH的耐药结果比较(表1)。

线性探针法与比例法检测RFP的耐药率分别为12.2%(46/378)和10.6%(40/378)，差异无统计学意义(χ2=3.60,P>0.05)，两种方法检测的总体一致率为97.4%(368/378)，具有很高的一致性(Kappa=0.87)。以比例法结果为金标准，线性探针检测对 RFP耐药的敏感度和特异度分别是95.0%(38/40)和97.6%(330/338)。

比例法检测对RFP敏感而线性探针法检测耐药的8株菌株,均存在野生型探针缺失(发生缺失的野生型探针分别是WT7缺失2株、WT8缺失4株、WT4并WT5缺失2株)，其中有2株为野生型探针缺失并rpoB基因突变，6株为单纯野生型探针缺陷而无rpoB基因突变。此8株菌株经过线性探针法重复试验，得到的结果与首次试验结果完全一致。

线性探针法与比例法检测INH的耐药率分别为14.3%(54/378)和12.2%(46/378)，差异无统计学意义(χ2=3.20，P>0.05)，两种方法检测的总体一致率为94.7%(358/378)，一致性较好(Kappa=0.77)。以比例法结果为金标准，线性探针法检测 INH耐药的敏感度和特异度分别是87.0%(40/46)和95.8%(318/332)。比例法检测对INH结果敏感而线性探针法检测耐药的14株菌株，均为低水平INH耐药，且均为WT1缺失并MUT1基因突变。此14株菌株经过线性探针法重复试验，得到的结果与首次试验结果完全一致。

二、 两种方法检测378株MTB临床分离株耐药的结果比较(表2)

线性探针法与比例法检测的耐多药率分别为7.4%(28/378)和7.9%(30/378)，差异无统计学意义(χ2=0.40，P>0.05)，两种方法检测的总体一致率为97.4%(368/378)，一致性较好(Kappa=0.81)。以比例法药敏结果为金标准，线性探针法检测耐药的敏感度和特异度分别是80.0%(24/30)和98.9%(344/348)。

比例法检测为耐药而GenoType®MTBDRplus检测为非耐药的6株菌株中，有4株为对INH的检测结果不符，2株为对RFP的检测结果不符。线性探针检测结果为耐药而比例法检测结果为非耐药的4株菌株，均为对RFP的检测结果不符。两种方法结果不同的菌株经线性探针法重复检测，得到结果与初次检测结果完全一致。

表1　两种方法检测378株MTB临床分离株对RFP和INH的耐药结果比较(株)

表2　两种方法检测378株MTB临床分离株耐药结果比较

注a:括号内分子为线性探针检测出的真耐药株数，分母为金标准检测出的耐药株数；b:括号内分子为线性探针检测出的真非耐药株数，分母为金标准检测出的非耐药株数

讨　　论

耐药结核病的早期诊断意义重大，但作为耐药结核病诊断金标准的传统药敏试验耗时长，容易造成诊断延误。

线性探针技术是分子生物学检测技术。GenoType®MTBDRplus分子线性探针法2008年推出，可以检测MTB是否对RFP耐药、对INH高水平耐药(katG带型异于野生型)和低水平耐药(inhA带型异于野生型)[8-11]。其基于MTB针对不同药物的基因突变位点不同，来判定MTB是否对RFP和INH耐药——通过检测rpoB基因突变确定对RFP的耐药性，通过检测katG基因和inhA基因的启动子区确定对INH的耐药性，能在24 h内完成对耐多药结核分枝杆菌的检测[12]，在我国一些地区已经推广应用[13-14]。

黑龙江省结核病参比实验室2009年引进线性探针技术，用于结核病对RFP和INH的耐药性检测。笔者选取2015年4月至2017年1月间用线性探针技术对378株MTB进行耐药性检测，并且与传统比例法药敏试验结果对比，评价线性探针技术检测结核分枝杆菌耐药性的效果，以期为本地区推广使用线性探针技术提供参考依据。

一、与传统比例法对比线性探针法检测的敏感度、特异度均较好

线性探针法检测是否对RFP耐药的结果与传统比例法检测结果的总体一致率为97.4%，其敏感度、特异度分别为95.0%和97.6%；对INH的检测结果与传统比例法检测结果的总体一致率为94.7%， 其敏感度、特异度分别为87.0%和95.8%；对耐药的检测结果与传统比例法的总体一致率为97.4%，敏感度、特异度分别为80.0%和98.9%。文献报道，线性探针法 检测MTB临床分离株是否对RFP耐药与传统药敏试验的一致率为95.7%～100.0%[15]，其敏感度及特异度均接近100.0%[16]；检测MTB是否对INH耐药与传统药敏试验的一致率为86.25%～89.00%[15]，其敏感度为70.00%～90.00%，特异度为100.00%[16]；检测MTB是否为耐药株的敏感度为85.7%～88.9%[17-18]，特异度为100.0%[17]。

二、线性探针法检测的重复性较好

本研究对28株MTB临床分离株进行了重复试验，得出了完全一致的实验结果。

三、 线性探针法获得药敏试验的结果更加快速

378例菌株从获得分枝杆菌分离株至报告是否耐药的结果，比例法药敏试验平均报告时间为42 d；线性探针试验平均报告时间为18 h。有资料显示，从提取核酸到报告耐药检测结果，线性探针法最快可以在6 h内完成；而传统药敏试验最多需要40～60 d[5]。故而在耐药结核病早期诊断方面线性探针法更具优势。

四、线性探针法检测结果便于保存、复核和分析

传统药敏试验结果是肉眼观察并记录培养基上的菌落数，计算耐药百分比判断耐药结果，结果判读后试验用的培养基则采用高压灭菌销毁。线性探针法以探针试条方式显示实验结果，试条可以粘贴在登记本上，将试条摄片后更可长期保存，使实验资料更完整，便于复核和分析。本实验室自2009年起的线性探针试验结果试纸条在室温避光条件下粘贴在登记本上，至今显色条带没有明显褪色。

《“十三五”全国结核病防治规划》要求，我国所有地市级定点医疗机构应该具备开展药敏试验、菌种鉴定和分子生物学诊断的能力。

而目前我省地市级实验室的耐药结核病诊断仍以比例法药敏试验为主，仅少数地市级结核病实验室开展了快速药敏试验，多数地市级实验室未开展快速药敏试验。我省地域辽阔，部分地市与所辖县区距离较远，目前采用县区级进行痰培养、地市级进行耐药性检测的结核病诊断模式，往往因菌株运输不及时，致使到达地市级实验室的菌株已过生长对数期，需重新传代才能做比例法药敏试验，使得结核病耐药性诊断的时间往往超过4周，甚至达到8周，影响了耐药结核病的及时诊断和治疗。

实验室开展新的检测技术常需要较多资金投入，高成本问题也常是制约新技术推广的重要因素。一项关于线性探针技术与传统药敏试验检测耐药结核病的成本比较显示，线性探针技术检测结核病患者耐药性的单位平均成本明显低于传统药敏试验[14]。

综上所述，笔者认为线性探针技术适用于目前我省地市级结核病实验室的耐药结核病诊断。

作为分子生物学诊断方法，为了降低污染风险，线性探针法要求实验室有合理的基础设施、专用的PCR空间及技术熟练的实验员[19-20]。对于污染问题必须以预防为主，笔者按照分子生物学检测技术质量保证的要求[21]，做到严格地进行实验室分区、实现实验室管理规范和安全防护，实验员技术培训要求充分达标。建议实验室完全达到分子生物学检测技术质量保证要求的条件后，再开展此项诊断工作。

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