涂阳肺结核患者痰标本直接法固体药物敏感性 试验结果分析

陈丽　邬剑　秦玉宝　唐鹭　苏欣　张艳

耐药结核病、特别是耐多药结核病是目前我国结核病控制领域的最大难题[1]。耐药结核病是指结核病患者感染的结核分枝杆菌经体外药物敏感性试验(简称“药敏试验”)证实对一种及以上的抗结核药物耐药，耐多药结核病是指结核分枝杆菌同时对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药。药敏试验在耐药结核病的诊断和指导治疗过程中起着重要作用。本研究对389例涂阳肺结核患者的痰标本进行RFP和 INH的直接法固体药敏试验，并与传统比例法药敏试验结果做对比，分析直接法固体药敏试验对耐药结核病诊断的临床应用效果。

材料和方法

一、材料来源

1.标本来源：收集2010年2月至2011年7月就诊于黑龙江省五常市和双城市两个结核病实验室的389例经痰涂片抗酸染色镜检确定为涂阳肺结核患者的痰标本。初治患者标本301例，复治患者标本88例。

2.培养基来源：直接法药敏试验所需培养基有酸性罗氏培养基、含40.0 μg/ml RFP的酸性罗氏培养基、含0.2 μg/ml INH的酸性罗氏培养基；比例法药敏试验所用的培养基有中性罗氏培养基、40.0 μg/ml RFP含药培养基、0.2 μg/ml INH含药培养基；菌种鉴别用0.5 mg/ml的对硝基苯甲酸(PNB)培养基。所有培养基均为本实验室自制。酸性罗氏培养基、中性罗氏培养基、PNB培养基、比例法RFP含药培养基，以及INH含药培养基的制作方法按照《结核病诊断实验室检验规程》[2]。直接法药敏培养基的制作方法为以酸性罗氏培养基为原液，分别加入相应含量的RFP、INH溶液，制成含RFP 40.0 μg/ml的酸性罗氏培养基、含INH 0.2 μg/ml的酸性罗氏培养基。

二、研究方法

痰标本抗酸染色镜检、直接法痰标本分枝杆菌固体培养、比例法分枝杆菌药敏试验均严格按照《结核病诊断实验室检验规程》[2]规范操作。

1. 涂阳痰标本：萋-尼染色镜检法确定涂阳痰标本。

2. 直接法固体药敏试验：视痰标本性状，将1～2倍体积的4% NaOH加入有痰标本的前处理管内，旋紧处理管螺旋盖，计时15 min，涡旋振荡30 s直至痰标本液化，室温静置至15 min计时结束，用无菌吸管吸取前处理后的痰标本，分别均匀接种于酸性罗氏培养基(直接法药敏的对照培养基)、含40 μg/ml RFP的酸性罗氏培养基(直接法RFP培养基)、含0.2 μg/ml INH的酸性罗氏培养基(直接法INH培养基)，每支管接种0.1～0.15 ml。在36 ℃ 条件下进行孵育。每周在登记本上记录所有培养基上菌落的生长情况，直至第8周。

耐药性的判断方法分两种：耐药百分比判断法和菌落数判断法。耐药百分比判断法为以对照培养基上有菌落生长为前提，含药培养基生长的菌落数/对照培养基生长的菌落数>1%判定为耐药，否则为敏感；对照培养基上无菌落生长的标本不纳入本次评价。菌落数判断法为以对照培养基上有菌落生长为前提，含药培养基菌落数多于20个判断为该药耐药，否则为敏感。

3. 比例法药敏试验和菌种鉴定：用酸性罗氏培养基上分枝杆菌培养阳性的菌株，做传统比例法药敏试验和PNB培养基生长试验，试验方法和结果判读依照《结核病诊断实验室检验规程》[1]。

4. 统计学分析：应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计算直接法固体药敏试验的各检测效能指标，各项指标计算方法：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；符合率=(真阳性例数+真阴性例数)/总检测人数×100%。一致性比较采用Kappa检验，Kappa≥0.75表示两者一致性较好。不同方法检测阳性率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计意义。

结　　果

1.检测结果：直接法药敏试验的389例涂阳患者痰标本培养时对照管培养基发生污染3例，涂阳培阴15例，获得分枝杆菌培养阳性菌株371例，经PNB培养基鉴别为NTM的3例，MTB 的368例；比例法药敏试验的371例阳性分离株试验时有20例因污染等原因无法判读耐药性结果；直接法RFP药敏试验有5例因污染未获得药敏试验结果，直接法INH药敏试验有13例因污染未获得药敏试验结果。剔除因污染、涂阳培阴等原因无法获得药敏试验结果的标本，最终两种方法均获得RFP药敏试验结果的346例，均获得INH药敏试验结果的338例，可供分析菌株包含3株NTM菌株。

2.RFP耐药性检测结果：两种方法检测346例涂阳患者痰标本的对RFP药敏试验的结果见表1。比例法检测的RFP耐药率为13.9%(48/346)。当直接法固体药敏试验结果以>1%作为耐药界限时，检测的RFP耐药率为10.4%(36/346)，两种方法检测耐药率的差异有统计学意义(χ2=24.14，P<0.01)。以比例法药敏试验结果为标准，直接法固体药敏试验对RFP进行耐药检测的敏感度、特异度、一致率、阳性预测值、阴性预测值分别为75.0%(36/48)、82.9%(247/298)、81.8%(283/346)、41.4%(36/87)、95.4%(247/259)，两种方法检测结果的一致性一般(Kappa=0.43)。

当直接法固体药敏试验结果以20个菌落为耐药界限时，检测的RFP耐药率为10.4%(36/346)，与比例法检测耐药率的差异有统计学意义(χ2=15.87,P<0.01)。以比例法药敏试验结果为标准，直接法固体药敏试验对RFP耐药检测的敏感度、特异度、一致率、阳性预测值、阴性预测值分别为75.0%(36/48)、86.2%(257/298)、84.7%(293/346)、46.8%(36/77)、95.5%(257/269)，两种方法检测结果的一致性一般(Kappa=0.49)。

3.INH耐药检测结果：两种方法检测338例涂阳患者痰标本的INH药敏试验结果见表2。比例法检测的INH耐药率为10.9%(37/338)。当直接法固体药敏试验结果以>1%作为耐药界限时，检测的INH耐药率为7.1%(24/338)，两种方法检测耐药率的差异有统计学意义(χ2=15.29，P<0.01)。

表1　比例法药敏试验与直接法固体药敏试验检测RFP耐药结果的比较(例)

表2　比例法药敏试验与直接法固体药敏试验检测INH耐药结果的比较(例)

以比例法药敏试验结果为标准，直接法固体药敏试验对INH耐药检测的敏感度、特异度、一致率、阳性预测值、阴性预测值分别为64.9%(24/37)、86.0%(259/301)、83.7%(283/338)、36.4%(24/66)、95.2%(259/272)，两种方法检测结果的一致性一般(Kappa=0.39)。

当直接法固体药敏试验结果以20个菌落为耐药界限时，检测的INH耐药率为7.1%(24/338)，与比例法检测耐药率的差异有统计学意义(χ2=9.38，P<0.01)。以比例法药敏试验结果为标准，直接法固体药敏试验对INH耐药检测的敏感度、特异度、一致率、阳性预测值、阴性预测值分别为64.9%(24/37)、88.7%(267/301)、86.1%(291/338)、41.4%(24/58)、95.4%(267/280)， 两种方法检测结果的一致性一般(Kappa=0.43)。

讨　　论

目前我国结核病实验室对于耐药结核病诊断常规实验室检测主要是细菌学固体药敏试验，包括直接法和间接法，间接法的比例法药敏试验是1996世界卫生组织在我国开展耐药监测以来广泛在结核病实验室应用的方法[3]，已被公认为耐药结核病诊断的金标准，而直接法固体药敏试验的应用效果近年来鲜有报导。笔者对比分析389例涂阳肺结核患者的痰标本对RFP和INH进行的直接法固体药敏试验与传统的比例法药敏试验结果，认为直接法固体药敏试验与痰标本分离培养同时进行，无需额外特殊处理，操作相对简单，与传统比例法药敏试验用培养阳性菌株做试验相比可能存在优势，但从两种方法检验结果分析来看，直接法固体药敏试验结果与比例法药敏试验结果存在一定差距。

本研究结果显示，直接法药敏试验无论采用哪种耐药界限，耐药率检测结果均低于比例法。直接法分别以>1%为耐药检测界限和20个菌落生长作为耐药检测界限时检测的RFP的耐药率均为10.4%，低于比例法检测RFP耐药率(13.9%)，且两种方法检测结果的一致性一般(Kappa值分别为0.43和0.49)。直接法分别以>1%为耐药检测界限和20个菌落生长作为耐药检测界限时检测INH的耐药率均为7.1%，低于比例法检测的INH耐药率(10.9%)，且两种方法检测结果的一致性一般(Kappa值分别为0.39和0.43)。阳性预测值上表现的差别更为明显：直接法药敏试验以>1%作为耐药检测界限时，对RFP和INH耐药检测的阳性预测值分别为41.4%和36.4%；以20个菌落生长作为耐药检测界限时，对RFP和INH耐药检测的阳性预测值分别为46.8%和41.1%。至于2种方法的一致率稍好(都在80%以上)，考虑主要是敏感菌株所占比例较大所致。另外，本研究也存在一定局限性，如样本数量过小，以及进行痰样本直接法药敏试验时，未增加噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)、PNB和28 ℃ 培养基对菌种作同步鉴别，由此会对本研究的结果产生一定的影响。

综上所述，笔者认为直接法固体药敏试验对于耐药结核病检测的临床意义不大，其检测结果不可作为耐药结核病和耐多药结核病的诊断依据。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2017.Geneva: World Health Organization,2017.

[2] 赵雁林, 逄宇. 结核病实验室检验规程. 北京: 人民卫生出版社, 2015.

[3] 张贺秋, 赵雁林. 现代结核病诊断技术. 北京: 人民卫生出版社, 2013: 199-200.