新疆亚麻籽油香气指纹图谱的构建与研究

魏长庆　周　琦　陈　卓　王永瑞　李　琳　刘文玉

(石河子大学食品学院；新疆植物药资源利用教育部重点实验室1，石河子　832000) (油料脂质化学与营养湖北省重点实验室2，武汉　430000)

亚麻是世界十大油料作物之一，我国亚麻种植面积约占世界亚麻种植总面积的18%，产量占世界亚麻总产量的17%[1]。亚麻油是我国西部地区老百姓最喜爱的油种之一，多采用纯物理炒籽压榨工艺制备，因而具有浓郁的香气及丰富的营养价值[2]。然而，由于亚麻油价格高于其他常见食用油，部分生产者便在亚麻油中添加其他劣质、低廉植物油造成亚麻油市场混乱局面出现，仅靠亚麻油性状、形态和简单理化指标来判断亚麻油品质优劣有一定的局限性。

近年来，利用挥发性特征香气成分对不同植物油进行有效判别和评价的相关研究成为热点[3-6]。然而，仅从少数几种特征挥发性成分的检测是不能真正全面地判别植物油质量的优劣，也无法达到有效控制植物油品质的目的，而特征香气指纹图谱技术能很好的解决这个问题，它所具有的整体性与模糊性可以避免某一个或一类具体成分的检测分析而忽略整体上控制样品品质的弊端。目前，有关亚麻油香气指纹图谱构建的相关研究鲜见报道。

在对新疆亚麻油特征香气成分分析研究基础上，以挥发性成分种类多、含量高且香气浓郁的YY-3号亚麻油为研究对象，采用GC-MS对新疆不同来源的炒籽亚麻油样品进行挥发性物质分析比较，结合GC-O确认其共有挥发性物质中具有香味活性的指纹信息，构建新疆亚麻油特征香气指纹图谱库并进行相似度评价，同时结合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的鉴别模型，对新疆不同来源亚麻油进行鉴别和监控，以期为新疆亚麻油品质控制、升级及品质认证提供依据。

1　材料与方法

1.1　实验材料

以新疆主产亚麻品种伊亚-3号(YY-3)为研究原料，从新疆伊犁伊宁县、昭苏县、尼勒克县、巩留县、新源县、特克斯采集6个样本(样本编号1～6)，阿克苏、塔城地区和奇台县采集3个样本(样本编号7～9)，共采集9个样本，分别由新疆石河子汇昌粮油公司和新疆博乐新赛油脂股份有限公司采集提供，每个样本采集3份，手工剔除有瑕疵、缺陷及虫害的亚麻籽，水洗干净并快速干制，低温避光保存，备用。棉籽油(M)、大豆油(D)、菜籽油(C)、花生油(H)、葵花油(K)：新疆石河子农贸市场；自制掺假亚麻油样本(亚麻油与掺假油质量比1:1)：掺菜籽油(YC)、掺棉籽油(YM)、掺大豆油(YD)；炒籽亚麻油(二级)：新疆石河子汇昌粮油公司；C6～C23正构烷烃，色谱纯：上海化学试剂公司；正己烷，环己烷(沸程60～90 ℃)，分析纯：上海生工生物工程有限公司；戊醛、己醛、庚醛、苯甲醛、3-甲基-2-丁烯醛，2-己酮，己醇，辛醇，丁醇，乙酸，丙酸，己酸，戊酸，丁内酯，乙酸乙酯，正十三烷烃，正十四烷，正十六烷烃，2-甲基吡嗪，2,5-二甲基吡嗪，2,3-二甲基吡嗪，环己醇，均为色谱纯：美国Sigma公司。

1.2　实验设备

SPME萃取装置、(50/30 μm)DVB/CAR/PDMS；GC-MS气相色谱质谱联用仪；GC-O嗅闻系统OP275嗅闻端口；830-T1红外线温度计；滚筒炒籽机；家用螺杆挤压榨油机；Alpha M.O.S-FOX 3000电子鼻系统。

1.3　炒籽亚麻油的制备

采用可控温的家用螺杆榨油机制备。榨油前，先通过电加热环将螺杆压头加热至95 ℃。将预处理后的10 kg亚麻籽置于滚筒炒籽机中炒籽，滚筒采用电加热(200 ℃)，炒籽过程中为防籽料受热不均，需不停搅拌滚动，直至有亚麻油特征香气出现，立即在预热好的热榨机中进行压榨取油，然后将热榨亚麻油离心去除沉淀，装入25 mL棕色玻璃瓶中，充氮密封，避光低温保存。不同品种来源亚麻油样品均采用该方法制备，经预实验确定最佳炒籽条件为200 ℃，40 min。

1.4　炒籽亚麻油GC-MS分析

1.4.1SPME/GC-MS分析条件

SPME条件：萃取头使用之前按照说明书，将不同萃取头于250 ℃的温度下，老化100～120 min，直至无干扰杂峰出现。然后称取10 g亚麻油样品置于125 mL带硅胶盖顶空瓶中，加入1%的内标物环己醇溶液10 μL，加盖密封后置于40 ℃恒温水浴，采用恒温磁力搅拌富集30 min，然后置于250 ℃的GC进样口解吸3 min并启用采集程序。

色谱条件：选用(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm df DB-WAX，美国SUPELCO)石英毛细柱；载气为氦气，流速0.8 mL/min，进样口温度250 ℃；程序升温条件为：首先40 ℃保留3 min，再以6 ℃/min升到120 ℃，然后10 ℃/min升到230 ℃，保留8 min；质谱条件为离子源温度200 ℃，电离方式EI，灯丝发射电流200 μA，电子能量70 ev，接口温度250 ℃，扫描质量范围为33～373 u。

1.4.2挥发性化合物定性

GC-MS实验数据由系统自带软件(Xcalibur)处理完成，亚麻油样品中挥发性组分经计算机检索并与商业计算机谱库NIST和WILEY比对分析，只记录匹配度≥800的挥发性物质。在同样色谱条件下，以C6～C23的正构烷烃混合物为标准，对其进行GC-MS分析并根据公式计算待测化合物x(待测化合物x的调整保留时间介于两个正构烷烃之间)的保留指数(Retention Index，RI)。定性挥发性物质的保留指数可通过标准化合物进行对比确定，也可以通过质谱数据库检索结果或查阅文献与之进行比较定性。保留指数(RI)计算公式如下：

式中：tRx为待测化合物x的调整保留时间；tRn为碳原子数为n的正构烷烃调整保留时间；tRn+1为碳原子数为n+1的正构烷烃调整保留时间；n为碳原子数。

1.4.3挥发性化合物的定量

本实验中鉴定分析的挥发性物质浓度并非绝对浓度，而是相对于内标物的相对浓度，为半定量分析。计算公式如下：

1.5　炒籽亚麻油GC-O分析

SPME萃取条件、样品预处理方法、GC条件、MS条件及定量方法同1.4.1，采用质谱和嗅闻器间的分流进样(1:1)。经前期训练的感官评价员通过嗅闻仪器端口进行样品评定，并对同一亚麻油样品至少进行两次及以上的嗅闻评价，只有当至少两名感官评价人员在同一时间做出相同的感官描述，对应该时间处描述词汇才能被记录。本次感官评定试验选择3分气味强度值定义标度的时间强度法(OSME)法(1=弱；2=一般；3=强)。

1.6　香气指纹图谱的建立方法

1.6.1共有峰的提取

在上述实验条件下，经GC-MS分析所得到的亚麻油中挥发性物质相对较多，因此在指纹图谱构建过程中须选择一个挥发性物质色谱峰作为参考峰，经GC-MS分析可知，该参考峰对应挥发性物质为己醇。通过计算不同来源亚麻油挥发性物质色谱峰的相对保留时间α和相对峰面积Sr，初步确定各共有峰作为样品的特征指纹峰。相对峰面积计算公式和相对保留时间计算公式如下:

Sr=Sri/Srs

α=tri/trs

式中：Sri为待测峰绝对峰面积，Srs为参考峰的绝对峰面积；tri为待测峰绝对保留时间，trs为参考峰的绝对保留时间。

1.6.2方法学考察

选择6号亚麻油样本作为考察对象，以前期预实验确定的己醇为参照峰，进行精密度实验(重复进样3次)、重复性实验(平行样品3份)以及稳定性实验(每间隔8 h取样测定，共6组)，计算不同亚麻油中各挥发性物质的相对保留时间和相对峰面积。

1.6.3相似度评价

参照中药指纹图谱相似度评价的方法[7]，以前期建立的新疆亚麻油样品中挥发性香气物质的共有模式为对照，分别采用峰重叠率、相关系数计算出各样品与共有模式的相似度，峰重叠率计算公式如下：

1.7　数据分析

聚类分析(HCA)采用SPSS 19.0软件处理；主成分分析(PCA)采用Unscramber 9.0软件；偏最小二乘回归-判别分析(PLS-DA)采用SIMCA-P 11.5软件；使用Origin 8.5和Excel绘图。

2　结果与讨论

由前面研究可知，亚麻油整体香气是一种多组分复杂体系，不同来源、不同工艺制备的亚麻油与个别挥发性成分有一定的相关性，但通过个别挥发性香气成分的测定，很难有效评价不同亚麻油的来源及其真伪优劣，而亚麻油香气特征指纹图谱技术所具有的整体性与模糊性特点可以避免上述弊端的出现，通过待测样品与特征指纹图谱比对间接判别待测样品。

GC特别适于植物油中挥发性香气指纹图谱的研究。阮健等[8]采用GC分析结合中药指纹图谱计算软件构建了当归挥发油的特征指纹图谱。钱浩全等[9]也采用GC建立了高良姜挥发油的指纹图谱，并利用其验证发现样品与混淆品有明显的区别。因此，本实验仍然采用SPME-GC/MS技术分析新疆不同产地来源亚麻油的挥发性香气物质组成，并构建相应特征香气指纹图谱。

2.1　共有峰的提取

基于6号样本中己醇的对应色谱峰的分离度和强度相对较好，且为所有亚麻油样品所共有，因此将其作为参照峰。在此基础上计算选择Sr>1%的共有峰进行比较选择，见表1和表2。

由各个亚麻油样本的GC-MS图可以看出(图1)，不同来源亚麻油样本在出峰时间上相似度较高，而各个峰含量却存在差异。在9个亚麻油样本中共分析鉴别出57种挥发性化合物，主要包括16种醛类、8种醇类、7种酮类、4种羧酸、5种酯类、4种烷烃、10种杂环类和3种其他挥发性物质。在以上挥发性物质中，共有46种物质均在所有亚麻油样本中出现。由表2可知，不同来源亚麻油挥发性化合物相对峰面积大于l%的共有峰共有36个，这些峰初步可视为不同亚麻油样本的特征香气峰。然而，对于不同亚麻油挥发性物质而言，由于阈值不同的原因，含量相对较高的成分未必对亚麻油整体香气有显著贡献作用[10-11]。因此，亚麻油特征香气指纹图谱构建过程需要结合GC-O分析，选择对亚麻油整体香气贡献较大的挥发性物质。通过GC-O分析鉴别，在原有特征指纹图谱的基础上又筛选出22种亚麻油特征香气物质作为新疆亚麻油共有的挥发性香气物质，并建立了新疆亚麻油特征香气指纹图谱。

2.2　新疆亚麻油特征香气指纹图谱构建方法的验证

特征指纹图谱构建过程中，构建方法的精确与否，直接会影响到后续特征香气指纹信息的准确度，因此，需要对指纹图谱构建方法的精密度、重复性和样品的稳定性进行考察[12-13]，见表4。

表1　共有峰相对保留时间

表1(续)

表2　共有指纹峰相对面积

表2(续)

图1　不同亚麻油样本相似度度分析

表3　亚麻油特征香气指纹图谱信息

编号名称RI1)香味描述鉴别方式2)1己醛1078油脂味,香草味A,B,C2(E,E)-2,4-戊二烯醛1488青草味,油脂味B,C3庚醛1185炒籽味,杏仁味,坚果味A,B,C4E-2-己烯醛1206香草味,炒籽味,杏仁味B,C5辛醛1249香草味,橘子味,蜂蜜味B,C6壬醛1394杏仁味,花香味,花生味B,C7(E,E)-2,4-己二烯醛1297青草味,甜香味,谷香味C8(E,E)-2,4-庚二烯醛1488香草味,甜香味B,C92-己酮1145炒籽味A,B,C10E-3-辛烯-2-酮1298杏仁味,谷香味,蘑菇味C11(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮1458杏仁味,酸味C12己醇1351杏仁味,青草味A,B,C13辛醇1545油脂味,黄油味A,B,C14戊醇1240甜香味,香草味B,C15乙酸1422酸味,辛辣味A,B,C16丁内酯1621炒籽味,甜香味,焦糖味A,B,C17γ-己内酯2456甜香味,杏仁味C182-乙基呋喃1024炒籽味,谷香味C191-甲基吡嗪1273炒籽味,坚果味B,C202-甲基吡嗪1263坚果味,炒籽味A,B,C21三甲基吡嗪1400炒籽味,花香味B,C22α-蒎烯1056青草味,松木味B,C

注：1):采用DB-Wax分析时的RI；2)：A.与标准品一致，B.与文献保留指数一致，C.与MS质谱数据库一致[21-25]。

表4　指纹图谱构建方法的精密度、重复性和稳定性研究

注：1)：挥发性化合物1-22代表GC-O-MS分析鉴别的新疆亚麻油中22种特征香气物质。

如表4所示，该测定方法相对保留时间的精密度在0.05%～0.78%，而挥发性化合物含量的精密度在0.54%～3.19%之间；重复性实验结果表明各个峰的保留时间的标准偏差为0.10%～0.38%，峰面积的重复率的标准偏差为1.12%～4.88%；不同间隔时间取样测定样品的稳定性的标准偏差(包括峰的保留时间和峰面积)也分别在0.04%～0.33%和0.89%～4.55%之间，并且亚麻油特征香气指纹峰的相对保留时间值的标准偏差小于1.0%，相对峰面积的标准偏差均小于2.0%，说明所建立的方法用于不同亚麻油香气特征指纹图谱的分析具有良好的精密度和稳定性。

2.3　新疆亚麻油特征香气指纹图谱的评价

新疆亚麻油特征香气指纹图谱的相似度评价可以量化描述样品的相似性，并具有指纹图谱整体性和模糊性基本特点，既能够体现指纹图谱的整体相关性，又可用于不同来源亚麻油的品质评价和质量判别[14]。图谱相似度评价方法主要包括距离系数法(基于图谱间差异程度评价指纹图谱相似度)、夹角余弦和相关系数法(采用图谱之间相似性评价其相似度)及改进Nei系数法(相似性基础上利用差异度来评价相似度)[15-20]。

先将所选定的9个不同产地的亚麻油样本、3个市场常见掺假亚麻油样本及其他5个植物油样本进行GC-MS分析，并将对应挥发性物质色谱峰取其相对峰面积的均值后，建立不同来源油挥发性物质的共有模式，通过与新疆亚麻油特征香气指纹图谱的对比分析，采用峰重叠率、相关系数计算出不同植物油样品与共有模式的相似度，通过比较分析来说明不同样品之间相似性和差异性。结果如图2所示。

由图1可以看出，除样品7对应亚麻油的峰重叠率小于0.90外，其余新疆亚麻油共有挥发性物质的峰重叠率均大于0.90(图2)，表明所选定的新疆亚麻油样本所构建的新疆亚麻油特征香气指纹信息准确可靠。通过计算相关系数发现，除样品7以外(相关系数0.833)，所有亚麻油样品均在0.915以上，说明所选亚麻油样品较为稳定，各个批次亚麻油样品在挥发性香气物质方面与特征香气指纹图谱基本吻合，存在较高的相似度，这与前期GC-MS分析结果基本一致。另外，新疆亚麻油特征香气指纹图谱还可以应用于掺假亚麻油样品和其他植物油样品的判别分析，由图可以看出3个常见掺假亚麻油样品的峰重叠率均低于0.70，只有掺入菜籽油的亚麻油(YC)相关系数接近0.80，而其他5种不同植物油样品的相关系数和峰重叠率低于0.60。基于以上结论，利用新疆亚麻油特征香气指纹图谱进行待测亚麻油样品的来源及品质优劣的判别是可行的。

3　结论

3.1采用GC-MS从新疆亚麻籽油中鉴定出57种主要香气成分，选用22个特征指纹峰(其峰面积占总峰面积的78.20%)，并结合GC-O建立了新疆亚麻籽油的香气成分的GC-O-MS指纹图谱；并采用夹角余弦法和相关系数法对指纹图谱进行了分析，发现9个新疆亚麻籽油样品具有较好的相似性。

3.2聚类分析表明，不同产地的新疆亚麻籽油样品得到了较好的聚类。GC-O-MS指纹图谱结合聚类分析法可为新疆亚麻籽油的产地判别提供科学参考。

3.3本研究所建立的指纹图谱是新疆亚麻籽油所特有的，它标示了新疆亚麻籽油中这些共有香气成分在组成比例关系等方面的共性特点。

3.4通过对掺假亚麻油样品和其他植物油样品的判别分析，利用新疆亚麻油特征香气指纹图谱进行待测亚麻油样品的来源及品质优劣的判别是可行的。

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