Aurora A调控活性氧对卵巢癌顺铂耐药的影响

杨丽娜，杨宇琦，杨　恭，陈亚萍

1.复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科，上海 200240；2.复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；3.复旦大学附属上海市第五人民医院中心实验室，上海 200240

化疗耐药是卵巢癌临床治疗的一大难题，研究细胞耐药机制并开发靶向药物可明显提升肿瘤的治疗效果。极光激酶A（Aurora A kinase，Aurora A）属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，参与调控细胞有丝分裂过程。Aurora A扩增导致多极纺锤体和非整倍体细胞的形成，诱导基因不稳定性从而促进肿瘤发生［1］。有研究表明，Aurora A可通过调控DNA损伤修复、抑制细胞凋亡及抑制自噬等多种途径促进细胞对化疗药物（如顺铂、紫杉醇及依托泊苷）的耐药［2-4］。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要由含氧自由基和易于形成自由基的过氧化物组成。ROS作为信号分子，可调节细胞增殖、分化及免疫反应等［5］。肿瘤细胞内ROS水平高于正常细胞，因此，诱导ROS升高的分子可用于肿瘤的靶向治疗［6］。在顺铂、紫杉醇和多柔比星耐药的卵巢癌细胞株中，ROS清除酶谷胱甘肽过氧化物酶3（glutathione peroxidase 3，GPX3）上调，氧化应激诱导基因UDP-葡萄糖醛酸转移酶家族1成员A6（UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6，UGT1A6）下调［7］，提示耐药细胞株中ROS水平低于敏感细胞株。

在骨肉瘤中，Aurora A抑制剂MLN8237促进细胞凋亡和自噬，同时MLN8237诱导ROS生成［8］；在慢性粒细胞性白血病中，Aurora A抑制剂AKI603通过诱导衰老从而逆转细胞的耐药性，此过程伴随ROS的升高［9］，表明Aurora A抑制剂可诱导ROS产生。但Aurora A蛋白对细胞内ROS的调控及ROS在Aurora A介导的化疗耐药中的作用仍不明确。

本研究利用慢病毒感染的方式在人卵巢癌细胞中分别导入Aurora A cDNA和shRNA，构建Aurora A过表达和沉默的稳转细胞系，利用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（2’, 7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和蛋白［质］印迹法（Western blot）等探讨ROS在Aurora A介导的化疗耐药中的作用，为卵巢癌的临床用药提供参考。

1　材料和方法

1.1　材料和主要试剂

人卵巢癌细胞株HEY、OVCA429、A2780和OVCA420购自美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC），A2780顺铂耐药株A2780/CDDP为课题组自备。病毒包装细胞HEK293T购自ATCC。RPMI-1640培养基和DMEM培养基购自美国Sigma公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，Aurora A抗体、CDK6抗体、p-AMPKα（Thr172）抗体和AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）抗体购自美国CST公司，GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin抗体购自美国Sigma公司，二抗购自美国Sigma公司，DCFH-DA染液购自北京普利莱基因技术有限公司，MTT和顺铂购自美国Sigma公司，N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）购自生工生物工程（（上海）股份有限公司，ECL发光液购自美国Millipore公司。

1.2　实验方法

1.2.1细胞培养

卵巢癌细胞株的培养选用含10%FBS的RPMI-1640培养基，HEK293T的培养选用含10%FBS的DMEM培养基，细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.2.2构建稳定转染细胞系

构建稳定转染细胞系的方法参照参考文献［2］。shAurora A靶向序列为：5’-GUCUUGUGUCCUUCAAAUU-3’。分别构建Aurora A过表达细胞株OVCA420 Aurora A及对照细胞株OVCA420 Vector，Aurora A沉默细胞株OVCA429 shAurora A及对照细胞株OVCA429 shGFP。

1.2.3采用Western blot检测蛋白水平

接种等量细胞于6 cm培养皿中，培养48 h后收集细胞。用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂）裂解得到全细胞蛋白，经蛋白定量后加入上样缓冲液配成相同浓度的蛋白样品，100 ℃，煮样5 min。取30 μg蛋白样品进行Western blot检测。经转膜、封闭后加入一抗温育过夜。洗涤后，加入二抗，室温温育1 h，洗涤去除非特异结合后，利用ECL发光液进行显影。显影仪器为FlourChem E。

1.2.4采用DCFH-DA法检测细胞内ROS含量

接种等量细胞于12孔板中，培养过夜后，加入10 μmol/L DCFH-DA染液，37 ℃避光温育30 min。用1×PBS清洗细胞，并在荧光显微镜下拍照记录。

接种等量细胞于酶标板中，培养过夜后，加入10 μmol/L DCFH-DA染液，37 ℃避光温育30 min。用1×PBS清洗细胞，并在多功能酶标仪中读取荧光值，激发波长502 nm，发射波长530 nm。

1.2.5采用MTT法检测顺铂的IC50

取对数生长期细胞，按1×104个细胞/孔接种于96孔板中，培养过夜。按指定浓度加入顺铂和NAC，温育48 h后小心弃上清，每孔加入180 μL培养基和20 μL MTT（5 mg/mL），温育4 h后，弃上清，加入150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），温育10 min，利用酶标仪检测490 nm波长下各孔的吸光度（D）值，并利用Graphpad Prism计算半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）。

1.2.6培养基pH值测定

接种等量细胞于6 cm的细胞培养皿中，分别在培养24和48 h时收集细胞培养基于15 mL离心管中，利用pH计测定培养基的pH值［10］。

1.3　统计学处理

采用Graphpad Prism进行数据统计及作图，结果以x±s的形式表示，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1　细胞内ROS与顺铂耐药

利用细胞内ROS特异性染液DCFH-DA检测，发现与卵巢癌细胞株A2780相比，顺铂耐药株（A2780/CDDP）的细胞内ROS水平降低（图1A、B），提示在卵巢癌中顺铂耐药与ROS的降低有关。在A2780和A2780/CDDP中加入ROS清除剂NAC（5 mmol/L），降低细胞内ROS含量后，利用MTT法检测顺铂的IC50，发现NAC促进细胞对顺铂的耐药（图1C、D），说明降低细胞内ROS促进细胞对顺铂耐药。

2.2　Aurora A在卵巢癌细胞株中的表达及稳定转染细胞株的鉴定

Western blot检测Aurora A在4种常见卵巢癌细胞株HEY、OVCA420、A2780和OVCA429中的水平，发现Aurora A在HEY和OVCA429中高表达，而在OVCA420和A2780中低表达（图2A）。因此，在OVCA420中导入Aurora A cDNA，构建Aurora A过表达细胞株，即OVCA420 Aurora A，对照组细胞导入空载体，即OVCA420 Vector；在OVCA429中导入Aurora A shRNA，构建Aurora A沉默细胞株，即OVCA429 shAurora A，对照细胞组导入靶向GFP的shRNA，即OVCA429 shGFP。Western blot检测Aurora A及Aurora A下游蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）的表达，发现导入Aurora A cDNA后，Aurora A和CDK6的表达明显升高，而导入Aurora A shRNA降低了Aurora A和CDK6的表达（图2B），说明Aurora A过表达和沉默细胞株构建成功，可用于下一步实验。

2.3　Aurora A调控细胞内ROS

DCFH-DA法检测稳转细胞的细胞内ROS，发现与对照组相比，Aurora A 过表达，ROS降低；而Aurora A沉默后，ROS升高（图3A、B），说明Aurora A可调节细胞内ROS的变化。

图1　A2780和顺铂耐药株A2780/CDDP的ROS含量和顺铂的IC50Fig. 1　ROS and IC50 of cisplatin in A2780 and A2780/CDDPA: ROS levels were observed under a fluorescent microscope; B: ROS levels were examined by a multimode reader; C: IC50 values of cisplatin were detected by MTT; D: Statistical analysis of IC50; *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.000 1

图2　Aurora A的表达及Aurora A过表达/沉默细胞系的鉴定Fig. 2　Expression of Aurora A in ovarian cancer cells and validation of Aurora A in established cell linesA: Detection of the basal level of Aurora A in ovarian cancer cell lines; B: Validation of Aurora A in established overexpresson or knockdown cell lines

2.4　抑制细胞内ROS促进Aurora A介导的顺铂耐药

Aurora A过表达，ROS降低，细胞对顺铂耐药，加入NAC进一步降低ROS后，增强细胞对顺铂的耐药性（图4A、B）；Aurora A沉默，ROS升高，细胞对顺铂敏感，加入NAC降低ROS后，促进了细胞对顺铂耐药（图4C、D）。表明ROS参与Aurora A调控的顺铂耐药。

2.5　Aurora A抑制ROS的分子机制

信号转导通路检测发现，Aurora A过表达促进AMPK第172位苏氨酸（Thr172）的磷酸化，而Aurora A沉默后，AMPK磷酸化水平降低（图5A）。AMPK磷酸化可增强细胞对葡萄糖的摄入，促进糖酵解，抑制ROS生成［11］，提示过表达Aurora A可能促进糖酵解过程。进一步检测发现，糖酵解关键酶类甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）受Aurora A调控，Aurora A过表达，GAPDH表达升高（图5A）。糖酵解过程中葡萄糖被代谢生成乳酸，而细胞培养基中酚红可指示培养基的酸碱度变化，发现细胞培养过程中Aurora A过表达导致细胞培养液由红色转变为黄色（图5B）。分别收集24和48 h的细胞培养液进行检测，结果显示，Aurora A过表达，培养液酸度增强（pH明显降低），而Aurora A沉默，酸度减弱（图5B、C）。上述结果表明，Aurora A促进糖酵解过程，抑制ROS。

图3　Aurora A过表达/沉默细胞中ROS水平Fig. 3　ROS levels in Aurora A overexpression or knockdown cell linesA: ROS levels were observed under a fluorescent microscope; B: ROS levels were examined by a multimode reader; **: P<0.01; ***: P<0.000 1

图4　抑制ROS促进细胞对顺铂的耐药性Fig. 4　Inhibition of ROS promotes chemo-resistanceA: IC50 cisplatin values of cisplatin in OVCA420 cell lines detected by MTT; B: Statistical analysis of IC50 values in OVCA420 cell lines; C: IC50 values of cisplatin in OVCA429 cell lines detected by MTT; D: Statistical analysis of IC50 values in OVCA429 cell lines; *: P<0.05; **: P<0.01; ***:P<0.000 1

图5　Aurora A促进AMPK磷酸化及糖酵解Fig. 5　Aurora A promotes phosphorylation of AMPK and stimulates glycolysisA: Aurora A activates AMPK and upregulates GAPDH; B. pH changes of cell culture supernatants after incubation for 48 h; C: Statistical analysis of pH after incubation for 24 and 48 h

3　讨　论

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，在治疗过程中容易产生化疗耐药，导致肿瘤复发。肿瘤细胞内的ROS水平高于正常细胞，因此，诱导ROS升高可作为肿瘤治疗的候选策略［6］。有研究表明，耐药细胞株中ROS水平较其对照细胞株明显降低［12］。检测卵巢癌顺铂耐药株A2780/CDDP和对照组细胞A2780中的ROS，发现顺铂耐药株中ROS降低，提示ROS在卵巢癌的顺铂耐药中发挥重要作用。

以往研究发现，Aurora A抑制剂可诱导细胞内ROS升高，但Aurora A蛋白对ROS的调控目前并不清楚。本研究利用病毒感染的方式外源性导入Aurora A cDNA和shRNA，构建Aurora A过表达/沉默细胞株，检测Aurora A对细胞内ROS的影响。结果表明，Aurora A过表达，ROS降低；Aurora A沉默，ROS升高。加入ROS清除剂NAC后，细胞内ROS下降，顺铂的IC50增大，表明抑制ROS可促进细胞对顺铂的耐药。

AMPK受细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量调控，当AMP与ATP的比值升高时，AMPK发生磷酸化活化，增强细胞的葡萄糖摄取及加速糖酵解代谢［13］。此外，AMPK还可通过调控FOXO转录因子，促进抗氧化酶类如SOD、CAT，从而降低ROS水平［14］。有研究发现，在肝癌细胞中导入Aurora A shRNA，细胞内ATP含量降低，糖酵解相关基因ALDOC、GLUT1、GLS、PDK1、PFK1、PFKM和RPL23 mRNA显著降低［15］，提示Aurora A沉默后，糖酵解途径也受到抑制。本研究结果表明，Aurora A激活AMPK，上调糖酵解酶类GAPDH，并导致细胞培养液酸度增强，说明Aurora A促进糖酵解过程。细胞代谢向糖酵解转变可抑制细胞内ROS的生成［16］，提示Aurora A抑制ROS可能与AuroraA促进糖酵解有关。此外，AMPK介导的抗氧化机制在Aurora A抑制ROS的过程中是否发挥作用仍需进一步实验验证。

综上所述，在卵巢癌中过表达Aurora A降低了细胞内ROS水平；Aurora A沉默，升高细胞内ROS；并且ROS的降低促进了卵巢癌对顺铂的耐药性。而Aurora A抑制ROS与AMPK介导的能量代谢方式的转变有关。

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