二甲双胍对实验性糖尿病牙周炎大鼠牙周组织的影响

黄辉　黄炫赓　于大海

[摘要] 目的 研究实验性糖尿病牙周炎大鼠牙周组织的变化，探讨二甲双胍对其影响。 方法 将240只雄性大鼠随机分成实验组（二甲双胍治疗）、糖尿病牙周炎组、牙周炎组和空白对照组，每组各60只大鼠。动物模型建立后3周、6周和9周分批处死10只大鼠取样，测量实验牙近中牙槽嵴顶至釉牙骨质界的距离（CEJ-A），比较各组光密度值。 结果 在术后3周、6周和9周3个时间点，实验组大鼠的CEJ-A和光密度值高于空白对照组而低于糖尿病牙周炎组和单纯牙周炎组；而且随着时间的推移，糖尿病牙周炎组和单纯牙周炎组的CEJ-A值逐渐升高，实验组CEJ-A值逐渐下降，空白对照组则没有明显变化；除实验组光密度值逐渐下降，其他三组则没有明显变化。 结论 二甲双胍对实验性糖尿病牙周炎大鼠的牙周组织具有保护作用。

[关键词] 二甲双胍；大鼠；糖尿病；牙周炎

[中图分类号] R781.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）04-0043-04

[Abstract] Objective To investigate the changes in periodontium in rats with experimental diabetic periodontitis and estimate the influence of metformin on the periodontium. Methods 240 male rats were divided randomly to experimental group（metformin treatment）， diabetic periodontitis group， periodontitis group and control group， with 60 rats in each group. Every 10 rats were sacrificed at the time point of 3 weeks， 6 weeks and 9 weeks after the establishment of the model. The distance from alveolar crest to cemento-enamel junction（CEJ-A） was measured， and the optical density value amorg groups was compared. Results At postoperative 3w， 6w and 9w time points， the CEJ-A distance and optical density in the experimental group was higher than that of the control group， while less than that of the diabetic periodontitis group and periodontitis group. CEJ-A value in the diabetic periodontitis group and periodontitis group gradually increased over time， meanwhile， the value of the experimental group descended eventually， and that of the control group remained no noticeable changes. By contrast， optical density of experimental group gradually descended， while that of the other groups remained no changes. Conclusion Metformin has protective effect on periodontium of rats with experimental diabetic periodontitis.

[Key words] Metformin； Rat； Diabetes； Periodontitis

牙周炎在糖尿病人群中發病率较高，糖尿病人群中合并牙周炎者可高达85%～90%[1]。糖尿病可增加牙周炎的发病风险和加重牙周组织破坏程度，牙周炎与糖尿病相互影响，互为高危因素，牙周炎已被认为是糖尿病的第六大并发症[2]。作为治疗2 型糖尿病的一线用药，二甲双胍亦具有一定的抗炎[3]、抗氧化作用[4]。本研究探讨二甲双胍对实验性糖尿病牙周炎大鼠牙周组织的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

从广西医科大学动物中心分批采购同种系的清洁级Wistar雄性大鼠240只，200 g左右/只。由电脑生成随机数字，并由此随机分成实验组（糖尿病牙周炎大鼠+二甲双胍治疗）、糖尿病牙周炎组、单纯牙周炎组和空白对照组，每组各60只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体（CST公司，批号：9662S），免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K175622F），图像分析软件（美国BIO-RAD Laboratories公司），显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2.2 糖尿病模型建立 大鼠适应性喂养3 d，给予足量的饲料，自由饮水。禁食12 h，链脲佐菌素（STZ）使用前用0.1 mol/L pH4.5的枸橼酸缓冲液配制成2%浓度，按照60 mg/kg的剂量，一次性腹腔注射。3 d后取鼠尾静脉血检测血糖，血糖浓度≥19 mmol/L纳入实验组；<19 mmol/L则继续腹腔注射STZ（30 mg/kg），3 d后再测血糖，血糖浓度≥19 mmol/L继续纳入实验组，<19 mmol/L排除。

1.2.3 牙周炎模型建立 实验组、糖尿病牙周炎组大鼠在糖尿病模型建立3 d后，以及单纯牙周炎组大鼠在喂养3 d后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用直径0.2 mm正畸结扎丝加丝线结扎大鼠右上颌第一磨牙牙颈部。空白对照组大鼠适应性喂养3 d后，注射同等剂量的柠檬酸缓冲液。3 d后10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，不作干预待其自然苏醒。

1.2.4 模型建立后的喂养 实验组、糖尿病牙周炎組、单纯牙周炎组及空白对照组继续普通饲料喂养。实验组大鼠给予二甲双胍100 mg/（kg·d）灌胃，其他组给予同体积蒸馏水灌胃。

1.3检测指标

1.3.1 标本采集 在结扎后3周、6周和9周，每组每批处死10只大鼠，断头法处死大鼠，迅速分离大鼠上颌骨，在上颌中线处将其一分为二。通过大体照片及X线片观察右上颌第一磨牙牙槽骨吸收情况，截取的组织块脱钙、梯度脱水、石蜡包埋、切片，用于HE染色和细胞凋亡蛋白检测。

1.3.2 骨吸收测量 将石蜡切片用苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，德国DMR+Q550病理图像分析仪测量釉牙骨质界（CEJ）至第一磨牙近中牙槽嵴顶（A）的垂直距离（CEJ-A），以评价各组大鼠右上颌第一磨牙牙槽骨的吸收情况，均取5张切片的平均值。

1.3.3 光密度值检测 按说明进行操作。结果判断：Caspase-3阳性染色为细胞质和（或）细胞内棕黄色颗粒着色。将切片在高倍镜下（×400）观察，并随机选取3个有阳性细胞密集面且不重叠的视野，计算阳性细胞的平均光密度，以光密度值表示Caspase-3蛋白表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0统计学软件分析数据，计量资料采用重复测量方差分析，按α=0.05水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组CEJ-A和光密度值术后变化

所有实施步骤均由同一人完成。最终完成120只大鼠标本的采集，各组各指标数据见表1。

2.2 CEJ-A重复测量数据方差分析结果

见表2。CEJ-A的时间因素（F时间=93.860，P<0.001）以及时间和分组的交互作用（F时间×分组=82.579，P<0.001）有统计学意义，提示CEJ-A有随时间变化的趋势并且时间因素的作用随着分组的不同而不同。结合表3和图1可直观地看到，CEJ-A在不同组别、不同时间点方面有差异（F分组=1667.183，P<0.001）。在术后3周、6周和9周3个时间点，CEJ-A值最高为糖尿病牙周炎组，其次为单纯牙周炎组，再次实验组，空白对照组则最低；而且随着时间的推移，糖尿病牙周炎和单纯牙周炎组的CEJ-A值逐渐升高，实验组逐渐下降，空白对照组则没有明显变化。

2.3 光密度重复测量数据方差分析结果

如表2、表3所示，光密度的时间因素（F时间=197.396，P<0.001）、时间和分组的交互作用（F时间×分组=203.896，P<0.001）以及分组因素（F分组=125.735，P<0.001）差异有统计学意义，提示光密度有随时间变化的趋势，在不同组别、不同时间点有差异。结合图2可直观地看到，在术后3周、6周和9周3个时间点，光密度值最高是糖尿病牙周炎组，其次是单纯牙周炎组，再次实验组，空白对照组则最低；而且随着时间的推移，除实验组的光密度值逐渐下降，其他三组则没有明显变化。

3讨论

牙周炎是在病原体及其产物作用下，局部组织内免疫细胞大量浸润释放炎症介质，进一步激活巨噬细胞等免疫细胞释放细胞因子，大量炎性介质介导免疫细胞黏附聚集到炎症部位，从而造成局部组织破坏[5]。而糖尿病可引起持续更久的炎症反应，更多的附着丧失，更严重的牙槽骨吸收，使骨修复能力明显受损，妨碍新骨形成[6]。已有研究表明，糖尿病牙周炎大鼠牙周组织中骨衬细胞、成骨细胞和牙周膜成纤维细胞的凋亡增加，成骨细胞数目降低，骨形成减少[7]。在本次研究中我们也发现，在术后3周、6周和9周3个时间点，CEJ-A值最高是糖尿病牙周炎组，其次是单纯牙周炎组，再次实验组，空白对照组则最低；而且随着时间的推移，糖尿病牙周炎和单纯牙周炎组的CEJ-A值逐渐升高，实验组逐渐下降，空白对照组则没有明显变化。这说明糖尿病牙周炎大鼠牙周组织破坏最严重，其次是单纯牙周炎者，破坏较少的是使用二甲双胍喂养的大鼠牙周组织，提示二甲双胍对糖尿病牙周炎大鼠牙周组织具有保护作用。

细胞凋亡是细胞死亡的另一种形式，其机制是细胞内特定的信号分子启动，且由基因调控的自我消亡过程。炎症细胞的凋亡参与牙周炎的发生、发展过程[8]，而细胞凋亡在牙周炎牙槽骨吸收中起着重要作用[9]。Mashat等[10]研究曾表明糖尿病可增加Caspase-3的活性，并证实糖尿病牙周炎牙周组织丧失的重要机制是成纤维细胞和成骨细胞凋亡的增强。二甲双胍（Metformin）是 2型糖尿病治疗的一线用药，目前研究指出二甲双胍可以抑制细胞凋亡的发生[11，12]。为进一步探讨二甲双胍对骨组织的保护作用机制，我们也对大鼠牙周组织Caspase-3的表达进行检测。Caspase-3是Caspase家族在凋亡级联反应中最为关键的凋亡蛋白酶。Caspase-3激活后，可降解DNA损伤修复酶，同时激活核酸内切酶，促进细胞凋亡[13]。在研究中发现，光密度值表达最高的是糖尿病牙周炎组，其次是单纯牙周炎组，再次实验组，空白对照组则最低；而且随着时间的推移，除实验组的光密度值表达逐渐下降，其他三组没有明显变化。光密度值表达变化与CEJ-A的变化趋势是一致的，提示光密度值表达代表了细胞凋亡的变化，具体到牙周组织中就是CEJ-A的变化，也间接反映骨破坏的减少。而喂养二甲双胍的大鼠则有抗凋亡的表现，表现为光密度值活性下降，与王小芳等[14]的研究结果相似，其在原代心肌细胞的凋亡实验中也证实了二甲双胍可明显抑制Caspase-3的表达。其机制可能在于二甲双胍通过激活AMPK，抑制NF-κb的激活及活性氧族的生成，减少Caspase-3的表达[15]。

综上所述，二甲双胍可抑制凋亡蛋白的表达，减少成骨细胞的凋亡，减少骨破坏增加。因此，二甲双胍对实验性糖尿病牙周炎大鼠的牙周组织具有保护作用。

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（收稿日期：2017-11-15）