核心薄囊蕨类颈卵器多细胞起源的形态学观察

刘　晶，王　欣，檀龙云，刘保东*

(1 哈尔滨师范大学，哈尔滨 150025；2 黑龙江省普通高等学校植物生物学重点实验室，哈尔滨 150025)

颈卵器(archegonium)是苔藓、蕨类及部分裸子植物的雌性生殖器[1]，作为世代交替的关键环节，其发育过程也蕴藏着高等植物起源演化最保守、最稳定的系统演化信息[2]，历来是蕨类植物分类的重要依据[3]。早在1926年，Rogers等[4]就对Lygodiumpalmatum的卵发生过程进行过简要报道。其后，Bell等[5]、贾蕙宁等[6]和石磊等[7]分别报道了荚果蕨(Matteuciastruthiopteris)和蕨(Pteridiumaquilinumvar.latiusculum)等多种薄囊蕨类颈卵器的发生，都认为颈卵器是由配子体表面原始细胞分裂而形成；曹建国等先后就不同演化位置的代表植物即地钱(Marchantiapolymorpha)[8]、桂皮紫萁(OsmundacinnamomeaL. var.asiatica)[9]、阔鳞瘤蕨(Phymatosorushainanensis)[10]、蕨(Pteridiumaquilinumvar.latiusculum)[11]、水蕨(Ceratopteristhalictroides)[12]、扇叶铁线蕨(Adiantumflabellulatum)[13]、峨眉凤丫蕨(Coniogrammeemeiensis)[14]等的颈卵器进行了切片观察，在为讨论颈卵器植物系统演化提供了丰富资料的同时，发现了多种薄囊蕨类卵细胞上都存在受精孔，揭示了颈卵器植物精卵结合的重要特征。但是，迄今为止，对核心薄囊蕨类(core Leptosporangiatae)颈卵器起源的认识仍是由(一个)表面原始细胞发育而来的[1,15-17]，都没有关注腹部壁细胞的来源，即颈卵器是单细胞起源还是多细胞起源尚无准确的结论。

分子分类对蕨类植物的重要贡献之一是核心薄囊蕨类[18]的提出，该类群包括了桫椤科(Cyatheaceae)、蹄盖蕨科(Athyriaceae)、鳞毛蕨科(Dryopteridaceae)等薄囊蕨类的多数科属，结合近年关于桫椤科[19]、蚌壳蕨科(Dicksoniaceae)[20]、碗蕨科(Dennstaedtiaceae)[21]、凤尾蕨科(Pteridaceae)[22]、卤蕨科(Acrostichaceae)[23]、裸子蕨科(Hemionitidaceae)[24]、蹄盖蕨科[25]、金星蕨科(Thelypteridaceae)[26]、球子蕨科(Onocleaceae)[27]、实蕨科(Bolbitidaceae)[28]、骨碎补科(Davalliaceae)[29]和水龙骨科(Polypodiaceae)[24]颈卵器发育的最新资料，本研究以鳞毛蕨科的华北鳞毛蕨为材料，在人工培养条件下，用石蜡切片法详细观察了颈卵器尤其是壁细胞的发育过程和颈沟细胞、腹沟细胞、卵细胞等的发生与分化，以期揭示核心薄囊蕨类颈卵器的起源，为相关类群的有性生殖演化规律提供直观的形态学依据。

1　材料和方法

1.1　材　料

华北鳞毛蕨(Dryopterisgoeringiana(Kunze) Koidz.)孢子于2016年7月采自黑龙江省帽儿山。凭证标本现存于哈尔滨师范大学植物标本室(HANU)。

1.2　方　法

将成熟、新鲜的孢子叶装入密封纸袋内置于阴凉、干燥的环境中，孢子自然脱落后用硫酸纸收集，4 ℃冰箱保存。播种时，将孢子消毒并充分水洗，用黑龙江东部山区阔叶林下暗棕壤浸出液配制的1/2MS半固体琼脂培养基接种，置于(25±1) ℃、日光光照12 h·d-1、光照强度50 μmoL·m-2·s-1的环境中培养，定期取材镜检，经固定、脱水、石蜡包埋、切片后，用Olympus-SZX10显微镜镜检，排版时令全部图片的左侧为配子体生长点方向，上方为颈卵器开口方向。文中所有数值均为随机测得的20个数的平均值。

2　观察结果

华北鳞毛蕨自孢子培养50 d后配子体即可发育成熟，自生长点下方中肋的腹面发育出颈卵器。成熟颈卵器如果在一定时间内不能完成受精，其内部的卵将解体变为褐色，进而整个颈卵器萎缩。同一个配子体上的颈卵器是逐渐发生的，在中肋上可以发现十数个至数十个发育程度不同的颈卵器。切片发现所有颈卵器的发育过程都相同。

2.1　表面原始细胞的分裂

在成熟配子体近生长点的中肋腹面，首先是一个表面原始细胞(initial cell)体积增大，胞质变浓，核质比增加，先进行一次平周分裂产生上下2个细胞，上方的细胞为颈壁细胞(neck wall cell)，下方的细胞为内细胞(inner cell)，内细胞进行一次平周分裂，形成中央细胞(central cell)和基细胞(basal cell)(图版Ⅰ, 1)。颈壁细胞直径约25 μm，高约7 μm；中央细胞直径约20 μm，高约15 μm；基细胞直径约20 μm，高约12 μm。

颈壁细胞先后进行两次垂周分裂(图版Ⅰ, 2)，且分裂面相互垂直，形成表面观为“田”字型的4个颈壁细胞，此时中央细胞周围的配子体营养细胞胞质较稀，染色较浅(图版Ⅰ, 3)。4个颈壁细胞同时进行平周分裂，使得颈部向外隆起，而此时中央细胞只是体积增加，并未进行分裂(图版Ⅰ, 4)。

2.2　中央细胞的分裂与分化

当颈壁细胞达到2～3层即8～12个细胞时，中央细胞进行一次横分裂形成初生颈细胞(primary neck cell)和初生腹细胞(primary ventral cell)(图版Ⅰ, 5)。随着初生颈细胞和初生腹细胞的发育，颈沟逐渐形成(图版Ⅰ, 6)。颈壁细胞和配子体营养细胞相比体积较小，细胞核明显，细胞排列整齐，近生长点一侧的2列颈壁细胞一般为4～5层，远生长点一侧的2列一般为3～4层(图版Ⅰ, 6～10)。初生颈细胞分裂(图版Ⅰ, 7)，形成颈沟细胞(neck canal cell)，颈沟细胞具有上下2个核，且各具1个核仁，与中央细胞之间有明显的空隙，同时初生腹细胞进行一次不均等分裂(图版Ⅰ, 8)，近颈沟细胞的子细胞体积较小，为腹沟细胞(ventral canal cell)，另一枚体积较大的为卵细胞(egg cell)(图版Ⅰ, 9)。

2.3　腹壁细胞的发生

颈沟细胞、腹沟细胞、卵细胞呈直线排列，与颈壁间没有空隙，此时位于卵细胞周围的配子体营养细胞体积较大，核质比较小(图版Ⅰ, 10)。随着颈沟细胞的延长，颈卵器颈部向远生长点方向弯曲，颈壁与颈沟细胞间出现空隙(图版Ⅰ, 11)。继而腹沟细胞体积变小，先后与卵细胞和颈沟细胞之间出现空隙(图版Ⅰ, 12)。稍后腹沟细胞解体，形成质地均匀且浓密的、顶端钝圆的近帽状胼胝体(corpus callosum)(图版Ⅰ, 13)，其间，卵细胞周围的多个营养细胞的核质比显著增大，细胞核向卵细胞一侧靠近，这层营养细胞直接转变为颈卵器的部分腹壁细胞(ventral wall cell)(图版Ⅰ, 11～13)。随后颈沟细胞(图版Ⅰ, 14)开始解体，进而完全解体(图版Ⅰ, 15)，4枚盖细胞(cover cell)向外侧翻开，颈卵器遂发育成熟 (图版Ⅰ, 16)。较多切片观察显示，基细胞一般不进行分裂，少数能在腹沟细胞发生前进行一次垂周分裂，多数在胼胝体形成期间才进行一次或两次垂周分裂，形成卵下方的一层腹壁(图版Ⅰ, 15)。

3　讨　论

综合华北鳞毛蕨切片的观察结果，图1为本文归纳出颈卵器的发育模式。表明颈卵器腹壁细胞由两部分构成，一部分是卵细胞下的1层基细胞，另一部分是卵细胞周围的2层高度的腹壁细胞，而前者是来源于表面原始细胞，后者则是由配子体营养细胞直接转化而来，即颈卵器是由配子体的多个细胞共同发育而来，是多细胞起源的。这与经典理论所主张的薄囊蕨类的颈卵器只起源于配子体的一个表面原始细胞[1,15-16]，即单细胞起源论是不同的。

阴影部分为一个表面原始细胞的发育过程，部分腹壁(VWC)是配子体营养细胞直接转变而来图1　核心薄囊蕨类颈卵器发育模式Shadow is the development of initial cell, a part for ventral wall cells (VWC) are directly transformed from the vegetative cellsFig.1　Development model of archegonium of core leptosporangiatae

核心薄囊蕨类不仅包括同型孢子薄囊蕨类较进化的大多数科属，也包括苹科(Marsileaceae)等全部异型孢子薄囊蕨类[18]。最新研究表明，桫椤科[19]、蚌壳蕨科[20]、碗蕨科[21]、蕨科(Pteridiaceae)[11]、凤尾蕨科[22]、卤蕨科[23]、中国蕨科(Sinopteridaceae)[21]、铁线蕨科(Adiantaceae)[13]、水蕨科(Parkeriaceae)[12]、裸子蕨科[14,24]、蹄盖蕨科[25]、金星蕨科[26]、球子蕨科[27]、实蕨科[28]、骨碎补科[29]、水龙骨科[10,24]，以及资料显示的苹科(Marsileaceae)[15]等颈卵器的腹壁与华北鳞毛蕨的基本一致，都是由配子体的一个表面原始细胞和多个营养细胞共同发育而来，只有蚌壳蕨科[20]颈沟细胞为3～5核、卤蕨科[23]早期基细胞较大、实蕨科[28]的基细胞不分裂等非本质性区别，因此，笔者认为图1应该是核心薄囊蕨类颈卵器多细胞起源的基本发育模式。

从更大的范围来看，原始薄囊蕨纲(Protoleptosporangiopsida)紫萁科(Osmundaceae)的颈卵器颈壁由6～7层细胞组成[9]；厚囊蕨纲(Eusporangiopsida)的颈卵器没有基细胞，所有腹壁都是由配子体营养细胞转化而来[30]；松叶蕨(Psilotumnudum(L.) Beauv)[31]和木贼(EquisetumhyemaleL.)[32]都无基细胞；云贵水韭(Isotesyunguiensis)既无基细胞，又无腹沟细胞[33]等等，由此可见，核心薄囊蕨类的颈卵器发育与其它类群有本质区别，是现代分子分类系统的溯祖形态，具有可靠的系统学参考价值。

经典的真蕨类分类系统都是根据无性生殖器官即孢子囊起源的细胞数作为分纲的主要依据[1,15,18]，多细胞起源的归为厚囊蕨纲，单细胞起源的归为薄囊蕨纲[17]等等，反映出蕨类植物生殖器官来源的重要系统学价值。同样，颈卵器作为雌性生殖器官，既是完成精卵结合与胚胎发育的重要场所，又是世代交替的关键环节[1,15,17]，也应该具有相应的或更广泛的系统学意义，至少在颈卵器植物不同类群的演化地位、雌雄性器是否同源[15]这两个方面，都值得深入研究。至于受精以后的颈卵器由于胚胎发育的需要，多数类群的腹壁都能发育为2到多层的复杂结构[22,25]，但此时的颈卵器特征已不属于颈卵器起源这一范畴。

此外，一些资料在描述颈卵器发育时都把原始细胞第一次平周分裂产生的外侧子细胞称为盖细胞，该盖细胞将来发育为颈卵器的全部颈壁，包括成熟颈卵器颈壁末端能够向外翻转打开的4个盖细胞[15]，基于2个盖细胞的概念存在从属关系、逻辑上相互冲突，所以本文主张把原始细胞最早分裂出来的能够分化出全部颈壁的细胞改称为颈壁细胞(neck wall cell)，成熟颈卵器颈壁末端的4个细胞称为盖细胞。

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图版Ⅰ　华北鳞毛蕨(Dryopteris goeringiana (Kunze) Koidz.)颈卵器发育过程1.表面原始细胞的前两次分裂；2.颈壁细胞分裂中；3.中央细胞周围的细胞胞质变稀；4.基细胞偶有垂周分裂；5.中央细胞第一次垂周分裂；6.颈壁细胞核明显；7.初生颈细胞核分裂；8.初生腹细胞分裂；9.腹沟细胞形成；10.细胞排列紧密；11.卵等细胞周围出现空隙；12.腹沟细胞变形；13.卵周围营养细胞核增大；14.颈沟细胞开始解体；15.颈沟细胞解体；16.成熟颈卵器；BC.基细胞；CAL.胼胝体；CENC.中央细胞；COVC.盖细胞；E.卵细胞；NCC.颈沟细胞；NWC.颈壁细胞；PNC.初生颈细胞；PVC.初生腹细胞；VCC.腹沟细胞；VWC.腹壁细胞PlateⅠ　Developmental process of Dryopteris goeringiana (Kunze) Koidz.1.The first two divisions of initial cell; 2.Cell division in the neck wall; 3.The cytoplasm of the cells around the central cell become rare; 4.The basal cell occasionally divides; 5.The first anticlinal division of the central cell; 6.The nucleus of the neck wall cell is obvious; 7.Nuclear division of primary neck cell; 8.Primary ventral cell division; 9.Ventral canal cell formation; 10.Cells are arranged closely; 11.The spaces around the egg cell and other cells; 12.Cell deformation of ventral canal cell; 13.Nuclear enlargement of the nutrient cells around the egg cell; 14.The neck canal cells are disintegrating; 15.The neck canal cell has disintegrated; 16.The mellow archegonium; BC.Basal cell; CAL.Corpus callosum; CENC.Central cell; COVC.Cover cell; E.Egg cell; NCC.Neck canal cell; NWC.Neck wall cell; PNC.Primary neck cell; PVC.Primary ventral cell; VCC.Ventral canal cell; VWC.Ventral wall cell