地龙粉酶解用酶初步筛选

吕迎兰，刘　颖，王彦多，毛会秀，曹广超，王集会，高世杰*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南　250355；2.山东中医药大学 实验中心，山东 济南　250355)

地龙(蚯蚓)是钜蚓科动物参环毛蚓等的干燥体。李时珍在《本草纲目》中认为其具有通经活络、活血化瘀、等作用。现代研究表明，地龙具有抗血栓、抗肿瘤、免疫调节、降压平喘、抗癌等作用[1]。现代药理研究表明，动物类药材发挥药效作用的主要成分为小分子肽[2]。另有研究表明，动物药在酶解之后其生物活性普遍高于原品[3]。地龙体内含有多肽蛋白质类物质、还原糖、维生素和微量元素等成分[4]，因此，近年来，探究地龙体内的抗肿瘤活性成分一直是地龙研究的热点。

本课题组拟以地龙粉为底物，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶5种蛋白酶对地龙粉进行水解，同时以地龙粉水提液作为对照组，测定五种蛋白酶水解液的水解度，水解液冷冻干燥后，配制系列浓度的供试品溶液，以对肺腺癌细胞(A549)的抑制率为指标，对五种蛋白酶进行筛选，并初步确定最佳用酶，以期为提高地龙抗肿瘤活性、开发抗肿瘤新药提供新思路。

1　仪器与试剂

1.1　仪器

UV9100B型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；远红外辐射干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)；PHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；半微量凯式定氮仪；ST 16R高速冷冻离心机(默飞世尔科技(中国)有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；FA1004N万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；Memmert CO2培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)，EL340i型全自动酶标仪(Molecular Davices)。

1.2　试剂

胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司)；木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司)；甘氨酸(国药集团化学试剂有限公司)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(赛默飞世尔生物制品北京有限公司)；注射用顺铂(齐鲁制药有限公司)；MTT(武汉市盖云天生物技术有限公司)；茚三酮(上海源聚生物科技有限公司)；磷酸氢二钠，磷酸二氢钾(国药集团上海化学试剂有限公司)。

1.3　供试品

地龙冻干粉(自制)。批号：20170701。

1.4　实验细胞

肺腺癌细胞A549细胞株由山东省立医院提供。

2　实验方法

2.1　地龙粉的最佳用酶筛选

精密称取地龙粉6份，每份1.0000 g，分别置于150 mL具塞锥形瓶中，按配料比1∶30定量加入蒸馏水，超声提取30min，按表1条件进行实验，得6种地龙粉酶解粗液，然后分别在3000 r/min条件下,离心10min，抽滤，定容至100 mL，得地龙酶解液。将每种地龙粉酶解液分成两份，一份用于测定蛋白质水解度，另一份经冻干后用于药理实验。

表1　地龙粉酶解条件

2.2　酶解液中氨基肽氮含量的测定

2.2.1茚三酮显色剂的配制

精密称取茚三酮0.5 g，果糖0.3 g，磷酸氢二钠10 g，磷酸二氢钾6 g，用蒸馏水定容至100 mL。

2.2.2标准曲线的绘制

取0.1000 g干燥过的甘氨酸，加蒸馏水溶解后定容至100 mL，移取2 mL定容至100 mL，得 20μg/mL的溶液。分别取该溶液1、2、3、4、5 mL并定容到10 mL，得浓度为2、4、6、8、10μg/mL的标准溶液，分别取3 mL稀释液于试管中，加入 1.00 mL显色剂，混匀后沸水浴加热15min，冷水冷却，加入5 mL 40%乙醇溶液混匀，放置15min，在570 nm处测定吸光度A。以吸光度为横坐标，以甘氨酸标准溶液-NH2质量为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.36种样品中含量测定

取6 种地龙粉酶解液适量定量稀释到适宜的浓度，按“2.2.2”方法测定样品的吸光度A，利用标准曲线计算-NH2的含量，再乘以稀释倍数得水解液中总-NH2肽氮的含量。

2.3　半微量凯氏定氮法测定地龙冻干粉总氮量[5]

取地龙粉水提液8 mL，经消化、蒸馏、滴定过程，测定原料中总氮量。

2.4　水解度的计算

用2.2下茚三酮法计算出水解液中游离氨基肽氮含量，用2.3下半微量凯氏定氮法计算原料中总氮量，按以下公式计算水解度：

水解度(DH)%=已水解的肽键数/原料中总肽键数×100%=[(B-C)/(A-C)]×100%

式中：A：原料中的总氮数 B：水解液中的氨基氮数 C：原料中游离的氨基氮数

2.5　MTT法测定水解物对肺腺癌细胞(A549)的抑制率

2.5.1地龙提取物溶液的配制

精密称取10 mg地龙酶解液冻干粉，溶于10 mL 1640培养液中，配成含有效成分2 mg/mL的浓度，在无菌环境下用0.22 μm的滤膜过滤，然后用已滤菌的1640培养基依次稀释，配成0.125、0.25、 0.5、1、2 mg/mL的药物浓度梯度。

2.5.2细胞培养[6]

2.5.2.1细胞复苏

从超低温冰箱中取出冻存的肺腺癌细胞，迅速投入预先加热到37℃的灭菌水中，待冻存液融化后，以2000 r/min的转速离心三分钟，收集细胞，然后以含10%胎牛血清的1640新鲜培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养。约24 h后更换培养基。

2.5.2.2接种

待细胞生长至80%融合时，以0.25%的胰酶细胞消化液(含0.02%EDTA)进行消化，以每孔100μL接种于96孔板中，预留三个调零孔，调零孔只加不含血清的1640培养基，不加细胞。

2.5.2.3加药

待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组、空白对照组加100μL不含血清的1640培养基，其他给药组每孔分别加入含不同浓度地龙提取物的1640培养基100μL，每个浓度的药物重复5个孔，其中以地龙粉水提液为对照组。然后细胞在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。

2.5.3测定细胞抑制率

在每孔中加入5 mg/mL的 MTT溶液20 μL，于培养箱内避光反应4 h 。吸去上清液，然后加入 100 μL DMSO，用酶标仪于492 nm测定 OD值，按下式计算药物对细胞的抑制率。

细胞抑制率(%)=[1-(加药组OD-调零组)/(空白组OD-调零组)]×100%

3　结果与分析

3.1　氨基肽氮含量的测定结果

3.1.1标准曲线的绘制

以吸光度为横坐标，以甘氨酸标准溶液-NH2质量为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为:Y=0.7105x-0.0027，相关系数r2=0.9990。

3.1.2酶种类对样品中氨基肽氮含量影响

样品中氨基肽氮含量的测定结果如表2所示。

表2　水解液中氨基肽氮含量

从表2可看出：弹性蛋白酶作用下的地龙粉酶解液中-NH2的含量最高，其次是胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对应的水解液，木瓜蛋白酶水提液中-NH2最少。

3.2　酶种类对水解度的影响

利用半微量凯氏定氮法测得1.0000 g地龙粉中含氮量为48.7548 mg。根据2.4下水解度的计算公式可求出五种蛋白酶的水解度如图1所示。

从图中可看出弹性蛋白酶的水解度最大，为30.61%，其次是胰蛋白酶，胃蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，最后是木瓜蛋白酶，分别为：17.96%、9.42%、7.95%、3.04%。

图1五种蛋白酶的水解度

Fig.1Hydrolysis degree of five kinds of proteases

3.3　MTT法测定样品对肺腺癌细胞A549抑制率的影响

不同浓度梯度下6种地龙粉酶解液对肺腺癌细胞A549的抑制率如图2所示，由图2可知，药物浓度大于0.5 mg/mL时，弹性蛋白酶、胰蛋白酶水解液对肺腺癌细胞A549的抑制效果明显，胃蛋白酶水解液在药物浓度超过0.5 mg/mL时无抑制效果，而胰凝乳蛋白酶对地龙的水解液只在0.25 mg/mL时有抑制效果，木瓜蛋白酶水解液、地龙粉水提液无抑制效果。

图26种地龙水解液对肺腺癌细胞A549的抑制曲线

Fig.2Inhibition curves of 6 kinds of Hydrolysate of dragon's Dragon on lung adenocarcinoma A549

4　讨论

肺癌是严重影响人类生存的恶性肿瘤之一，其死亡率已居全球恶性肿瘤之首。对于肺癌的治疗，目前主要采取以化疗为主的综合治疗方案，其疗效并不理想，其主要原因是肺癌细胞可对化疗药物产生多药耐药性[7]。因此，寻找治疗肺腺癌的新型药物势在必行。

已有研究表明，生物活性肽具有抗癌功效且对机体正常组织细胞无毒副作用。酶解法水解蛋白质是目前制备生物活性多肽的最常用的方法，它能改善蛋白质的功能和理化性质，同时不降低其营养价值。本次实验采取酶解工艺，以弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶对地龙粉进行酶解，将地龙粉中的蛋白质分解为小分子多肽及寡肽等更具有药理活性的物质。

弹性蛋白酶具有广泛的水解活性，对明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质具有降解作用,是一种广谱的肽链内切酶[8]；胰蛋白酶作为一种水解酶，专一作用于有碱性氨基酸精氨酸及赖氨酸羧基所组成的肽键，酶本身很容易自溶，由原先的β-胰蛋白酶转化为α-胰蛋白酶，再进一步降解为拟胰蛋白酶，乃至碎片，活力也逐步下降而丧失[9]；胰凝乳蛋白酶活性基团含有丝氨酸残基，可在芳香族氨基酸的羧基处切断肽键；胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键；木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并优先水解在肽键的N-端具有两个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。本研究采用酶解工艺，用弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶分别对地龙粉进行酶解，理论上可将地龙粉中的蛋白质分解为小分子多肽及寡肽等更具有药理活性的物质。

本研究中各种酶对地龙粉的水解度大小为：弹性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶>胰凝乳蛋白酶>木瓜蛋白酶；其中胰蛋白酶酶解液在药理活性中最显著。由实验结果可看出水解度与药理活性并不是呈绝对的相关性。地龙粉由胰蛋白酶通过酶解工艺得到的酶解液中含有大量抑制肺腺癌细胞A549的小分子肽及活性物质，而通过木瓜蛋白酶得到的酶解液水解度低

且无抑癌效果，说明地龙粉通过木瓜蛋白酶酶解得到的小分子多肽等无抑癌作用。此外胃蛋白酶酶解液无明显的抑癌效果的原因可能是强酸环境破坏了某些具有生物活性的物质。由本研究可看出地龙中含有较多抗肺腺癌的活性物质，且胰蛋白酶酶解产物在抗肺癌方面的效果显著。

由实验结果可知，弹性蛋白酶可以较大程度的将地龙粉水解成小分子多肽，胰蛋白酶在抑制肺腺癌细胞方面效果最佳，而胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶对于地龙粉抗癌活性的提高无应用价值。

[1]杜航,孙佳明,郭晓庆,等.地龙的化学成分及药理作用[J].吉林中医药,2014(34):707-708.

[2]王爱华,柳美玲,戴志明,等.小肽的吸收机制与营养价值研究进展[J].上海畜牧兽医通讯,2008(2):7.

[3]王克夷.开发小肽,筛选新药[J].中国生化药物杂志,2003,24(1):48.

[4]何欢，李文平.地龙的主要成分及其作用的研究[J].畜牧兽医杂志,2008,27(3):28.

[5]国家药典委员会.中国药典2010年版.一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010：附录53-54.

[6]焦方文，王集会，邹龑，等.全蝎粉酶解工艺最佳用酶的初步筛选[J].时珍国医国药，2015，26(10)：2407-2408.

[7]刘小菊,刘红云,王海娟,等.肺腺癌A549/DDP细胞多药耐药机制及中药逆转剂的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015(21)：227-230.

[8]刘小杰，陈启和，孙桥.弹性蛋白酶的研究进展[J].中国食品添加剂，2004(4)：29-32.

[9]刘春雨，张盼盼，王颖,等.蜈蚣粉酶解工艺最佳用酶的初步筛选[J].中南药学，2017(6)：759-762.