超声辅助提取柚皮黄酮及其抗氧化性的研究

谭晶鑫，刘彦琳，赵容慧

(辽宁工业大学 化学与环境工程学院，辽宁 锦州　121001)

黄酮类化合物是一类重要的天然抗氧化剂，具有抑制自由基活性的抗氧化、抗衰老作用，增强人体免疫力的作用[1]。近年来，超声波辅助应用于植物细胞的破壁，有效地提高了有机物的吸收速率，缩短了提取时间，提高了效率[2]。超声波辅助提取是一种从天然产物中提取活性成分的新技术，它利用超声波产生振动能量，使细胞周围和细胞内产生环流，从而增强细胞壁和细胞膜的通透性，强化提取过程，有利于细胞中有效成分的提取[3]。柑橘类水果，如柚子具有很高的营养价值。而柚皮作为废料常常被丢弃。若以其为原料，规模化生产黄酮类化合物，则具有潜在的开发和利用价值及可观的经济效益[4-5]。本论文采用超声波辅助法提取柚皮中的黄酮，考察各因素对提取黄酮得率的影响，并考察所提黄酮的抗氧化活性。

1　实验

1.1　芦丁标准溶液的配制

本文采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测吸光度，选取芦丁配制芦丁标准溶液，在500 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线，得标准方程为A=6.625c-0.0135，线性系数R2=0.9997。

1.2　影响黄酮得率各因素的考察

1.3　黄酮抗氧化性的探究

分别稀释不同浓度的黄酮提取液，取5支比色管分别加入1 mL0.75 mmol/L的硫酸亚铁，再加入1 mL 0.01%的过氧化氢混匀后加入0.2 mol/L，pH值为7.40的磷酸缓冲液2 mL，将1 mL的黄酮提取液分别加入比色管中，加入1 mL 7.5 mmol/L的邻二氮菲。于37℃下温浴60min。以蒸馏水为空白对照测吸光度为AS，另取一支比色管，用蒸馏水代替过氧化氢，其吸光度为AB，再取一支比色管，用蒸馏水代替黄酮提取液，其吸光度为AP。羟基清除率的计算公式如下：

2　结果与分析

2.1　乙醇体积分数对黄酮得率的影响

如图1所示，随着乙醇体积分数的增大，黄酮得率呈现先升高后降低的趋势，这是由于随着乙醇体积分数的增大，溶于其中的黄酮类化合物也逐渐的增多；当乙醇体积分数达到60%时，黄酮类化合物得率最大，但当乙醇的体积分数超过60%后，得率下降，这可能是因为蛋白质等生物大分子的溶解性降低，使黄酮从组织细胞内向周围提取溶剂中扩散的传质阻力增大[6]。因此确定60%为适宜的乙醇体积分数。

图1　乙醇体积分数对柚皮黄酮得率的影响

2.2　料液比对黄酮得率的影响

图2　料液比对柚皮黄酮得率的影响

如图2所示，随着料液比的提高，总黄酮的得率先增加后减小。在低料液比范围内溶剂量的增加提高了样品系统与浸提剂体系间黄酮类物质的浓度差，使样品中有效成分的残留量减少，从而提高了黄酮的得率，当料液比达到1∶15后，总黄酮的得率降低，可能是因为料液比过大，增大了超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降，达到一定比例时，溶剂将样品中有效成分基本溶出，使黄酮得率基本趋于稳定，从提取效果、溶剂用量等方面综合考虑，料液比为1∶15提取效果最佳，所用溶剂的量最少，同时也降低了浓缩负荷，乙醇的用量不宜过大，因此，确定料液比为1∶15适宜。

2.3　提取时间对黄酮得率的影响

图3　提取时间对柚皮黄酮得率的影响

如图3，10min内得率变化很小，这是因为提取时间过短，总黄酮物质还没有充分的溶出；随着时间的延长，柚皮中黄酮类物质的得率逐渐增加，一定比例的乙醇已逐渐将柚皮中的有效成分基本溶出，提取在20min时黄酮得率最高。进一步增加提取时间，黄酮得率出现明显的下降趋势。超声波促进胞内的黄酮释放并扩散到胞外的溶剂中。大部分存在破碎细胞内的黄酮在最初的20min内释放到提取的溶剂中，因此黄酮得率显著增长。但是过长时间的超声波作用可能会导致部分黄酮发生降解，黄酮得率也随之下降，据此从浸提效果考虑初步确定20min为较适宜的提取时间。

2.4　提取功率对黄酮得率的影响

图4　提取功率对柚皮黄酮得率的影响

如图4，在100～200W的范围内，功率越高，对柚皮细胞的破坏作用越大，溶剂扩散越快，越有利于黄酮的浸出。但当功率大于175 W时。进一步提高超声功率，黄酮得率下降。因为过高的提取功率产生瞬间高温会使许多活性成分遭到破坏。所以选择175W为适宜的提取功率。

2.5　提取温度对黄酮得率的影响

图5　提取温度对柚皮黄酮得率的影响

由图5可知，当温度小于50℃时，随着温度的升高，黄酮类化合物得率呈上升趋势，当提取温度大于50℃时，得率反而下降。这可能是因为，初期随着提取温度的升高，分子运动速度加快，使柚皮中的黄酮大量溶出，从而提高了黄酮的得率，但温度过高也会破坏某些黄酮化合物的结构，因此选择50℃为适宜的提取温度。

2.6　柚皮黄酮的抗氧化作用

本研究以抗坏血酸和黄酮类化合物为对照，研究柚皮黄酮对自由基的清除作用。如图6所示，柚皮黄酮含量的增加，其黄酮类化合物对自由基清除能力增加，呈明显的量效关系。当柚皮黄酮含量为100 mg/L时。黄酮的清除率接近50%，在相同浓度下清除率高于Vc。因此，柚皮中的黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性。本实验初步测定了黄酮类化合物与自由基清除活性的关系，其机理有待进一步研究。

图6　柚皮黄酮与抗坏血酸对自由基清除作用

3　结论

(1)单因素试验中，保证其余条件相同的情况下，随着乙醇的浓度、提取功率和料液比的增加，黄酮得率先增高后降低，在乙醇浓度为60%、提取功率为175 W、料液比为1∶15时黄酮的得率最高；而提取时间和提取温度对黄酮的得率影响相对较小；

(2)柚皮黄酮对自由基清除能力比Vc对自由基清除能力高，具有良好的抗氧化作用。

[1]韩晓祥,周凌霄,励建荣,等.超声波辅助提取胡柚皮黄酮及抗氧化作用研究[J].中国食品学报,2011,11(4):55-60.

[2]廖维良,赵美顺,杨红.超声波辅助提取技术研究进展[J].广东药学院学报,2012,28(3):347-350.

[3]蒋志国.超声波提取柚皮中黄酮类化合物的工艺研究[D].儋州:华南热带农业大学,2006.

[4]王永菲,王成国.响应面法的理论与应用[J].中央民族大学学报,2005,14(3):236-241.

[5]李晓军,潘宏利.响应曲面法优化超声辅助提取金银花总黄酮[J].陕西师范大学学报,2009,4(1):12-15.

[6]Jiang Xue,Chen Yajie,Shi Lian'gen.Optimization of flavonoids extraction from Bombyx batryticatus using response surface methodology and evaluation of their antioxidant and anticancer activities in vitro[J].Food Science and Biotechnology,2013,28:367-379.