乳液聚合法制备PMMA/CS壳核纳微球的研究*

★高淑婷 张媛媛 乾康 万喜 刘伟婷 尹小英（.江西中医药大学药学院 南昌330004；.江西省中医药研究院 南昌　330046；3.上海工程技术大学化学化工学院 上海　060）

壳聚糖来源于一种用途广泛的生物材料甲壳素，这是一种广泛存在于蟹、虾壳中的多糖，在自然界有巨大的储存量［1］。壳聚糖现已广泛用于开发纳米材料，壳聚糖纳米粒的研究也成为热点，如包埋、吸附药物、核酸、蛋白质或者是酶活性方面的应用［2-3］。聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）是具有无定型结构的聚合物，具有良好的机械稳定性和良好的硬度［4］。在引发条件下壳聚糖与PMMA发生乳液聚合反应可在水溶液中形成壳核纳米粒，该纳米粒兼具良好机械性和生物相容性。

本实验在不使用乳化剂条件下，可制备得到PMMA/CS壳核纳米微球。在实验中，我们以氮气为保护剂，过硫酸铵（APS）作为引发剂，引发甲基丙烯酸甲酯（MMA）与壳聚糖的接枝共聚反应，合成纳米微球。研究了乳液聚合过程中温度、APS含量、MMA与CS质量配比对壳核纳米粒的粒径的影响并测定了粒径分布（PDI）、表面电位（zeta电位），然后通过三因素三水平正交试验分析了三因素对乳胶粒接枝率、接枝效率的影响。制备出大小均一，形貌较好，接枝率和接枝效率较高的纳米微球。同时本实验还考察了纳米粒对药物的负载和释放行为。

1　材料与设备

1.1试剂 壳聚糖（CS）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）（上海阿拉丁试剂有限公司）；过硫酸铵（APS）、冰醋酸（西陇化工股份有限公司）；苦参碱（南京普怡股份有限公司）；二次蒸馏水自制。

1.2仪器 DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（杭州瑞佳精密科学仪器有限公司）；BS214D型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Malvem纳米粒度仪（英国马尔文公司）；扫描电镜（德国）；透析袋（截留相对分子质量12000～14000）；DZF-6020型真空干燥箱（杭州瑞佳精密科学仪器有限公司）。

2　方法与结果

2.1壳聚糖的纯化 精密称取10g壳聚糖溶于500mL醋酸溶液（1%v/v）中，过夜，室温搅拌条件下用10g/L的氢氧化钠溶液调至pH=9析出，过滤，蒸馏水洗涤沉淀至pH=7，60℃真空干燥备用。

2.2PMMA/CS壳核纳米微球的制备 分别精密称取0.3g已纯化的壳聚糖，溶于30mL醋酸溶液（1%v/v）中，将溶液转入置于水浴锅并配备有温度计，冷凝管，磁力搅拌器，氮气入口的三口烧瓶中。升温至40℃使壳聚糖充分溶解，通氮气除去瓶中的氧气和二氧化碳。向烧瓶中加入一定量的MMA，通氮气30min，升温至一定温度。将不同量的APS分别添加到混合物中，在一定的温度下氮气保护搅拌3.5h。反应结束后，冷却，透析48h（透析袋截留相对分子量为12000～14000），除去未反应的MMA单体、MMA均聚物等杂质。离心（13000r/min）10min，去除上清液，50℃烘干至恒重。接枝率和接枝效率按下式计算：

接枝率=（m1-m0）/m0×100%

接枝效率=（m1-m）/m2×100%

式中：m0、m1、m2分别指CS、PMMA/CS微球和加入的MMA的质量。

2.3单因素实验与正交实验设计 首先分别考虑温度、MMA与CS的配比，APS的浓度对PMMA/CS纳米微球粒径的影响并测定其PDI、Zeta电位，然后根据单因素实验结果，设计正交试验因素与水平，列出正交实验因素与水平表1。

表1　因素与水平表

2.4测试表征 粒径分析：取适量干燥纳米粒粉末，加入适量蒸馏水超声分散30min成混悬液，采用Malvem公司Zetasizer Nano ZS90型纳米粒度与Zeta电位分析仪对粒度、粒度分布指数（PDI）、Zeta电位测定。纳米粒形貌表征：滴一滴纳米混悬液于载体玻片上，自然晾干后，喷金后用扫描电镜观测其形貌；红外光谱定性。

2.5温度对PMMA/CS纳米粒的影响 称取已纯化的壳聚糖0.3g溶于1%醋酸30mL，MMA与CS的质量配比为2∶1，加入APS的含量为0.009g，反应时间3.5h，固定这些条件不变，按2.2步骤，在不同温度下反应，研究其对聚合乳胶粒的影响，结果见表2。

表2　温度对纳米粒性能的影响

从表中数据可知在这4个温度下，均有纳米粒合成，其中在65℃、70℃、75℃下，温度对纳米粒的平均粒径的影响不大，并且粒径分布较为均匀，纳米粒的表面电位也在30mv左右，表明体系较为稳定。但在温度为80℃时，由于温度过高限制了APS与MMA和CS的接枝共聚反应引起接枝率低，粒径较小，干燥后纳米粒黏连，导致测得的粒径偏离正常值。

2.6MMA/CS配比对PMMA/CS纳米粒的影响 称取已纯化的壳聚糖0.3g溶于30mL的1%醋酸，加入APS的含量为0.009g，在70℃反应，反应时间3.5h，固定这些条件不变，按2.2步骤，仅改变MMA与CS质量比，研究其对聚合乳胶粒的影响，结果见表3。

表3　MMA/CS配比对纳米粒性能的影响

从表中数据可知，纳米粒的粒径在150～250nm之间，并且PDI值都在0.3以下，表明粒径分布较为均匀，Zeta电位都在30mv左右，体系较为稳定。2.7 APS浓度对PMMA/CS纳米粒粒径的影响 称取已纯化的壳聚糖0.3g溶于30mL的1%醋酸，MMA与CS的质量配比为2∶1，在70℃反应，反应时间3.5h，固定这些条件不变，按2.2步骤，改变APS的含量，研究其对聚合乳胶粒的影响，结果见表4。

表4　APS浓度对纳米粒性能的影响

2.8正交实验法研究PMMA/CS纳米粒微球 在单因素结果基础上，根据所列正交实验表进行九组实验，得到实验结果见表5。

表5　正交实验结果

2.8.2 正交实验结果的极差分析见表6。

表6　正交实验结果极差分析

图1　PMMA/CS壳核纳米微球的SEM照片

图2　PMMA/CS纳米粒红外光谱图

2.9PMMA/CS纳米微球负载苦参碱及药物释放考察

2.9.1PMMA/CS纳米微球负载苦参碱 取20mg苦参碱置于20mL棕色容量瓶中，用PBS=7.4的缓冲溶液定容。取1mL的苦参碱溶液，将与4mL的纳米微球溶液（0.5g/mL）在25℃下快速混合2h，然后将混合液置入透析袋（10000～14000）中，用50mL二次蒸馏水透析2h。通过紫外分光光度计在波长为208nm处检测透析液中游离药物的吸光值，与标准曲线对照并计算出质量，即未被负载苦参碱的质量，计算出负载率为57.4%。

标准曲线制作：将浓度分别为0、5、10、15、20、25μg/mL的苦参碱溶液置于波长为208nm的紫外分光光度计中测吸光度，计算其线性关系为Y=0.0364X+0.0077，r=0.9994.

负载率=（M0-M1）/M0×100%（M0是苦参碱的总质量，M1是未被负载苦参碱质量）

2.9.2PMMA/CS纳米微球负载苦参碱的药物释放测试 采用透析法考察负载苦参碱的纳米粒在PBS=7.4中的释放度。将洗去未被负载苦参碱的载药纳米粒置于透析袋（10000～14000）中，在25℃50mL的PBS=7.4溶液中释放介质。并在不同的时间取样测吸光度，计算释放率，见图3。可以看出苦参碱溶液在45min的时候释放率达到90%而被纳米粒负载的苦参碱在16h才接近90%，表明PMMA/CS对苦参碱的负载可延缓药物释放。

图3　负载苦参碱的PMMA/CS纳米粒与苦参碱溶液体外释放曲线

3　讨论

APS和CS上的氨基构成氧化还原体系，引发MMA在CS上的接枝共聚反应，红外图（见图2）可看出，1725cm-1，1149cm-1有明显吸收，表明MMA已接枝上去。由于PMMA的憎水性和CS的亲水性使其在水溶液中形成了微球型。本实验首先对其形成微球型进行单因素实验，结果表明温度、APS含量、MMA与CS质量配比对壳核纳米粒的粒径有一定的影响。并进行正交试验和对正交结果进行极差分析发现对接枝率和接枝效率影响为：配比＞APS含量＞温度；且表明5号接枝率和接枝效率都是最高的，粒径为217.5nm，PDI值为0.02，Zeta电位为34.4±7.11；SEM照片可看出合成的纳米微球形貌皆为有壳核的球，粒径大小都较为均一，分散性较好。因此在温度为70°，APS含量为0.018g，MMA/CS配比为10时，可获得性能较好，接枝率为88.1%，接枝效率为74.2%的纳米粒，并将其用于负载苦参碱和药物释放度测试，结果良好。综上所述，本研究确定了可形成稳定，大小均一，黏连度低的合成PMMA/CS微球的条件，且该方法简便，成本低。并且使用水溶性的无机物引发剂比使用有机油性引发剂更容易除去，减小残留物，更有利于此PMMA/CS纳米微球作为酶固定化的载体或药物载体。

［1］王芳宁,孙宾宾,周怡婷,等, 过硫酸铵引发丙烯酸甲酯接枝羧甲基甲壳素共聚[J].化学与生物工程, 2007, 24(6):18-20.

［2］Montri Ratanajanchai, Sunhapas Soodvilai,Nuttaporn Pimpha et al.Polyethylenimine-immobilized core-shell nanoparticles: synthesis,characterization, and biocompatibility test [J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2014, 34(1):377-83.

［3］Inphonlek S, Pimpha N, Sunintaboon P. Synthesis of poly(methyl methacrylate) core/chitosan-mixed-polyethyleneimine shell nanoparticles and their antibacterial property [J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2010, 77(2):219-226.

［4］Lee K D, Jeong Y I, Kim D H, et al. Cisplatin-incorporated nanoparticles of poly(acrylic acid-co-methyl methacrylate) copolymer [J]. Int J Nanomedicine, 2013(8):2 835-2 845.