阿苯达唑联合IFN-α抗小鼠细粒棘球蚴病的实验研究

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细粒棘球蚴病 (cystic echinococcosis， CE)是一种在全世界广泛分布并在部分区域呈现严重流行的蠕虫类人兽共患病[1]。我国是棘球蚴病发病最高的国家之一[2]。治疗CE通常依赖于手术和/或化疗，取决于多种的因素如囊肿的大小和位置、合并微生物感染、潜在危险并发症如囊肿破裂等[3-6]。作为手术治疗的补充，唯一可用的药物治疗CE的苯并咪唑氨基甲酸酯衍生物,即甲苯咪唑(MBZ)和阿苯达唑(ABZ)[7]。然而，有超过20%的CE病例对于这样的治疗效果不佳[8]。因此，迫切需要新型的、更有效的治疗方案。

干扰素(interferon, IFN)-α，属一类干扰素，最初主要被用于各种病毒性疾病的抗病毒治疗[9]。随后，IFN-α 被证实具有多种生物学功能，包括：抗病毒、抗肿瘤 及免疫调节等[9-10]。对于另一种棘球蚴病-泡球蚴病(AE)，有研究表明IFN-α具有积极的保护作用。Godot V 等研究证实IFN-α能够显著减小AE病人的病变囊泡[11]。 进一步研究发现，IFN-α 治疗AE的过程中能够逆转Th2型到Th1型免疫应答，而这有利于机体免疫对于包囊产生有效的保护性的免疫应答。在AE的研究中还发现，IFN-α能够减轻肝脏纤维化与损伤水平。然而，目前缺乏IFN-α对于CE治疗效果的研究。本研究旨在小鼠体内评价单独IFN-α及联合ABZ-IFN-α对于CE的治疗效果。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物所有动物实验均通过内蒙古包钢医院伦理委员会的审核批准。40只雌性Balb/c 小鼠(8周龄，18～20 g) 购自北京维通利华实验动物有限公司。实验动物饲养在一定室温控制(22±1 ℃)、光照 (12 h光照/黑暗 循环) 环境中。

1.1.2药物及试剂ABZ购自葛兰素史克公司, Pegasys○Rinterferon alfa-2a 购自罗氏制药有限公司。青霉素、链霉素、RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清 (FBS)均购自Invitrogen公司。Con-A 购自Sigma-Aldrich公司。小鼠IL-4, IL-10和 IFN-γ细胞因子ELISA检测试剂盒购自e-Bioscience公司。山羊抗小鼠IgE、IgG抗体及其亚型二抗购自Novagen 公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3原头蚴包囊从临床手术中分离获得后，迅速无菌地转移到实验室。通过注射器将囊液从包囊中吸出, 9 000×g 4 ℃离心20 min，弃上清，将沉淀原头蚴用含有双抗的PBS(pH 7.2，包含1 000 μg/mL青霉素和1 000 U/mL链霉素)洗两遍。原头蚴活性利用美兰排除实验进行鉴定[12]。 只有当原头蚴活性达到90%以上才会被用于接下来小鼠继发感染。继发感染使用的原头蚴终浓度是1 500个/200 μL PBS。

1.2实验方法

1.2.1实验设计通过腹腔注射继发感染40只雌性Balb/c 小鼠，每只小鼠感染重悬在200 μL PBS的1 500个新鲜的原头蚴。感染5个月后，小鼠被随机分配到4组(10只/组)：a) ABZ治疗组，小鼠每日灌胃ABZ (5 mg/kg)；b) IFN-α治疗组，小鼠每3 d肌肉注射IFN-α-2a 10 000 IU/50 μL；c) ABZ+IFN-α组，小鼠同时进行ABZ与IFN-α的治疗，剂量方法同a)和b)；d)未经治疗对照组。各组药物治疗维持2个月。随后，随后处死小鼠，检测相关指标评价治疗效果。

1.2.2检测寄生虫感染及分析治疗有效率解剖小鼠腹腔，检测每只小鼠的包囊数量、大小及重量。治疗有效率(基于感染小鼠包囊重量)通过下列公式计算[13]:

其中 Xc是未经治疗对照组平均包囊重量，Xt 是治疗组平均包囊重量。

1.2.3透射电子显微镜观察(Transmission electron microscopy，TEM)各组包囊样本经处理后用TEM进行检测[14]。包囊被切割为1 mm3大小并利用预冷的含2.5% 戊二醛的0.1 M PBS固定5 h。样本经0.1 M PBS洗两遍后，采用1%四氧化锇固定。样本随后经不同乙醇浓度梯度脱水后在等体积的氧化丙烯/环氧树脂中包埋过夜。随后，再次在新鲜的100%环氧树脂包埋24 h及在65 ℃包埋18h。采用超微切片机(Leica EM FC7)制备50-70 nm厚度的切片。随后放置到200-目的铜网，切片经饱和乙酸双氧铀及柠檬酸铅分别浸泡着色10 min和5 min。切片经蒸馏水清洗后自然干燥，利用TEM(H7650, 日立)检测。

1.2.4酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)首先， 将每只小鼠分离的脾细胞采用RPMI 1640培养基(含10%热灭活FBS)重悬，终浓度调整到5×106个脾细胞/mL，加入2.5 μg/mL Con-A (Sigma) 刺激剂37 ℃ 5% CO2孵育72 h后，收集培养上清用于检测IL-4, IL-10和 IFN-γ浓度。血清与细胞培养上清细胞因子的检测的具体步骤参见EILSA细胞因子检测试剂盒说明书。

ELISA检测血清抗体水平：用96孔微量板，每孔加入含有0.1 μg/μL 包囊粗抗原的0.1 M磷酸盐缓冲液 (pH 9.6)100 μL 4 ℃孵育过夜。血清以1∶100稀释到PBST 缓冲液 (pH 7.2, PBS 中含有0.05%吐温-20)中， 37 ℃孵育1 h。随后加入二抗，即以1∶1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG、IgG亚型和IgE。酶标仪(Bio-Rad)单波长490nm处检测吸光密度OD值。

1.3统计学分析所有数据均通过Prism 5.0 (GraphPad 软件)进行分析。结果表示为均数± 标准误。包囊重量、大小、细胞因子浓度与抗体水平均分别通过单因素方差检验进行分析。当P<0.05时，具有统计学差异。

2　结　果

2.1ABZ+IFN-α 治疗显著抑制包囊小鼠在实验过程无发现死亡，表明没有严重的药物副作用。小鼠处死时，4组小鼠平均小鼠体重没有统计学差异(P>0.05)。ABZ+IFN-α 治疗组的包囊数量与对照组(P<0.01)或ABZ组(P<0.05)相比显著下降，ABZ治疗组的包囊数量与对照组相比显著下降(P<0.01)。然而，IFN-α 治疗组包囊数量与对照组相比无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1对照组与不同治疗组的包囊数量
Tab.1The number of hydatid cysts in control and treated infected mice

分组Group每只小鼠的包囊数量EachnumberofcystinmiceMean±SEMABZ32214121322．100±0．314IFN⁃α47345162423．800±0．592ABZ+IFN⁃α11102112000．900±0．233ab对照组Untreatedcontrol54062335743．900±0．640

注：ABZ+IFN-α治疗组的包囊数量与未处理组(aP<0.01)或ABZ治疗组(bP<0.05)相比显著下降。

注：The number of cysts in treated group showed significant reduction from group untreated control (aP<0.01) or group ABZ (bP<0.05).

结果表明ABZ+IFN-α治疗组无论包囊重量还是大小，与对照组(P<0.01)或ABZ治疗组(P<0.05)相比均显著下降，ABZ+IFN-α治疗组的包囊抑制率达到89.7%，这些结果表明ABZ联合IFN-α治疗效果更显著，见表2。

表2不同处理组的包囊重量与大小
Tab.2Weights and size of hydatid cysts in control and treated infected mice

分组Group囊重(g)Weightofhydatidcyst包囊直径(mm)Sizeofhydatidcyst包囊抑制率(%)CystinhibitionrateABZ0．21±0．17a2．1±0．9a78．4IFN⁃α0．89±0．286．7±1．50．08ABZ+IFN⁃α0．10±0．05ab1．2±0．4ab89．7Untreatedcontrol0．97±0．457．3±3．2⁃

注：ABZ+IFN-α治疗组的包囊重量与大小与对照组(aP<0.01)或ABZ治疗组(bP<0.05)相比显著下降。

2.2ABZ+IFN-α治疗组的包囊超微结构的改变与破坏TEM用于观察不同处理组包囊超微结构的变化。结果表明，对照组的包囊呈现典型的细粒棘球蚴包囊结构，而ABZ+IFN-α治疗组出现了包囊超微结构的改变与破坏。见图1A和1B。在生发层，ABZ+IFN-α治疗的小鼠包囊中正常的未分化细胞、纤维组织、典型细胞核及核仁结构明显消失，取而代之的是细胞核碎裂与大量的脂滴，见图1C和1D，表明生发层产生子囊的能力被破坏。与对照组相比，ABZ+IFN-α治疗组的小鼠包囊典型的皮层与微毛微管结构消失，见图1E和1F。正常外层的非细胞的、富含糖成分的角质层被排列不规整、富含空泡结构的代替，见图1G和1H。

ABZ+IFN-α治疗组的变化：A、C、E和G；未治疗对照组的变化：B、D、F和H。A和B显示的是总体的包囊超微结构。C和D展示的是包囊生发层。E和F重点观察的是微管与外皮结构。F来自D的红色区域。G与H是包囊外层的层积层。在对照组，包囊具有角质层 (LL)、生发层(GL)、皮层(Te)、微管(Mt)、未分化细胞(UC)、纤维组织(F)、细胞核(Nu)与核仁(Nl)。ABZ+IFN-α治疗组的超微结构变化表明脂滴(Ld)和空泡(V)。ABZ+IFN-α treated group (A, C, E and G) and Untreated group (B, D, F and H). A and B showed the general ultrastructure of cysts. C and D showed germinal layer of cysts. E and F emphasized on changes of teguments and microtriches. F derived from red rectangle area of D. G and H represented laminated layer of cysts. In untreated group, the hydatid cyst appears almost normal laminated layer (LL), germinal layer (GL), tegument (Te), microtriches (Mt), undifferentiated cells (UC), fibrous tissue (F), cell nucleus (Nu) and nucleolus (Nl) are clearly visible. In ABZ+IFN-α treated group, ultrastructural alternations shows as lipid droplets (Ld) and vaculoles (V), nuclear fragmentation, degeneration and disappearance of microtriches (Mt), undifferentiated cells (UC), tegument (Te), and cellular elements. Each figure was labeled by a scale bar.图1　ABZ+IFN-α治疗组的包囊超微结构变化Fig.1　Ultrastructural modification of cyst wall and cyst components in ABZ+IFN-α treated group

2.3ABZ+IFN-α治疗显著降低了血清IL-10：为了检测治疗后细胞因子的生成情况，检查发现ABZ+IFN-α治疗组的血清IL-10浓度与对照组相比显著降低(2.29±0.25 ng/mL) vs. (3.44±0.14 ng/mL),P<0.01)(图2A)。IFN-γ(图 2B,P=0.08)与IL-4(图2C,P=0.11)在各组之间没有显著差别。

不同治疗组的小鼠血清分别使用ELISA试剂盒检测IFN-γ (A)、 IL-4 (B)和 IL-10 (C)浓度。a P<0.01。Sera of mice from diverse groups were collected respectively for detection of IFN-γ (A), IL-4 (B) and IL-10 (C) concentration using ELISA kit. a P<0.01.图2　ABZ+IFN-α治疗组血清IL-10显著下降Fig.2　Significant decrease of IL-10 in serum with ABZ+IFN-α treatment

2.4ABZ+IFN-α治疗显著降低了脾细胞分泌的IL-10：经检测，脾细胞分泌细胞因子情况并发现ABZ+IFN-α治疗组的IL-10分泌与对照组相比显著下降(0.91±0.10 ng/mL) vs. (1.99±0.17 ng/mL)，P<0.01)(图3A)。但是IFN-γ(图 3B,P=0.31)与IL-4(图3C,P=0.18)水平在各组之间没有显著差别。

不同治疗组的小鼠脾细胞上清分别使用ELISA试剂盒检测IFN-γ (A)、 IL-4 (B)和 IL-10 (C)浓度。a P<0.01。Cytokines production by spleen cells from diverse groups were collected respectively for detection of IFN-γ (A), IL-4 (B) and IL-10 (C) secretion using ELISA kit. a P<0.01.图3　ABZ+IFN-α治疗组的脾细胞分泌的IL-10显著降低Fig.3　Significant decrease of IL-10 in production in vitro with ABZ+IFN-α treatment

2.5ABZ+IFN-α治疗组的血清特异性抗体变化为了更好的了解该治疗对于特异性抗体水平的影响，本研究对不同处理组血清抗体进行了ELISA检测。结果表明，与单纯感染对照组相比，ABZ+IFN-α治疗组的IgG抗体持续下降，在治疗结束时(第60 d)显著下降(P<0.000 1，图4A)。同样，在治疗结束时，IgG抗体的亚型包括IgG1(P<0.000 1，图4B)、IgG2(P=0.029 9，图4C)与IgG4(P<0.000 1，图4D)均随着治疗显著降低。与此同时，联合治疗组IgE水平亦显著降低(P<0.000 1，图4E)。

图4　不同治疗组血清IgG、IgG1、 IgG2、 IgG4、 IgE和IgM的检测Fig.4　Detection of OD value profiles of sera IgG, IgG1, IgG2, IgG4, IgE and IgM in diverse treated groups

3　讨　论

在本研究中，评价了ABZ联合IFN-α对于CE的治疗效果。研究结果表明ABZ联合IFN-α在小鼠继发感染CE中具有更好的治疗效果。进一步证实该治疗效果可能与包囊超微结构的改变、降低的IL-10水平以及下调体液免疫有关。

IFN-α具有多种生物学功能包括抗病毒感染、抗肿瘤及免疫调节作用，但在蠕虫感染中的作用研究十分有限。但是值得一提的是在AE研究中，IFN-α减轻了人和小鼠的包囊病变[11, 15]。研究者进一步指出该作用与Th2型细胞因子向Th1型细胞因子逆转有关，包括下调IL-10、IL-6与IL-13，以及上调IFN-γ 水平[11]。 但是本研究显示仅仅 IFN-α并不能产生缓解CE的能力，也不能逆转Th细胞因子类型，说明仅仅IFN-α不能够打破慢性CE的Th2型免疫应答。该结果与之前在AE治疗的报道不同。然而IFN-α联合ABZ能够显著改善CE降低包囊负担，与ABZ组或对照组相比治疗效果显著见表1、2。进一步研究表明，该联合治疗能够显著下调IL-10。IL-10是典型的Th2型细胞因子，在 CE中抑制Th1保护性应答并帮助寄生虫逃避宿主免疫应答[16]。所以，该联合治疗取得更好的治疗效果可能与抑制了IL-10，降低了Th2型免疫应答有关。

体液免疫应答在CE发生发展过程中发挥重要作用，在感染的早期，通过激活补体、调理作用、ADCC作用等发挥重要的保护性免疫应答，而在感染的慢性期抗体尤其是IgG4类型具有保护虫体逃逸的作用[17-18]。在本研究联合治疗中的IgG、IgG1、IgG2、IgG4和IgE都显著下降，这表明在感染慢性期异常升高的体液免疫应答在该联合治疗中显著下调，其中IgG4也显著降低。但是，尽管IgG水平在联合治疗后显著下降，我们发现其水平仍高于阴性水平。这可能与感染的免疫记忆有关，但需要进一步的研究。总之，该联合治疗的治疗效果可能亦与下调对寄生虫有利的体液免疫有关。

在本研究中，ABZ+IFN-α或单独的IFN-α治疗都没有显著增加感染慢性期IFN-γ水平。这或许是与IFN-γ往往在感染早期(7-8 d)发挥重要的保护作用，而随后在感染的慢性期就会下降有关[19]。感染早期治疗对于IFN-γ的影响将会进一步研究。此外，有研究报道IFN-α通过增强树突状细胞(DC)细胞递呈抗原发挥抗肿瘤作用[20-21]，但是DC细胞是否在该联合治疗中发挥作用仍需探究。

总之，本研究证实ABZ联合IFN-α对于CE具有更好的治疗效果，为CE治疗提供了实验依据。

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