根霉透析膜培养技术及其应用

张素琴，司会

（苏州农业职业技术学院，江苏苏州 215008）

在旧时制曲中，根霉的培养多采用固体传统培养方法，根霉接种在含水量不超过60%的固体基质上进行生长繁殖，固体基质既是根霉生长代谢的碳源，又是微生物生长的微环境[1]。这种方法虽然工艺简单，设备可因陋就简，在我国已沿袭千年之久，但生产效率低、劳动强度大、产品质量不稳定。20世纪70年代，上海工业微生物研究所和上海藕粉厂联合推出液体培养根霉，实现了工业化、连续化生产，但液体深层发酵工艺要求高，操作尤其严格，设备投资一次性较大，难以掌握推广[2]。20世纪80年代，苏州市第二米厂采用液、固结合法培养根霉，节省了菌种，扩大了生产规模。为提高生产效率，克服根霉在固体培养、液体培养中的不足，借鉴无土栽培蔬菜的原理，经过不断探索和试验，提出了根霉透析膜培养技术，该方法兼具固、液体培养各自的优点，同时又避免它们的某些缺陷，实际上是固态培养、液态培养的折中法[3]。所谓透析培养是通过透析膜调节物质转移而进行的微生物培养方法，在培养单菌种时，则在两相的一方培养微生物，另一方则作为培养基贮槽，营养物质的扩散和生物量的累积是在两相之间的透析膜上进行的，其优点是可以增加生物量的积累，达到很高的细胞密度，同时可节省培养基原料，提高菌体收率。微生物的透析膜培养技术在国外已有数十年历史，在我国还鲜有报道，尚未有专题研究，现将根霉透析膜培养技术试验成果和应用价值报道如下。

1 根霉培养特性的研究

根霉在固体培养基上进行无性繁殖过程，孢子发芽长出芽管，接着伸出絮状菌丝，在营养丰富的麦芽汁琼脂斜面培养基上，菌丝沿斜面表面蔓延伸展，匍匐菌丝粗壮发达，形成较厚的膜层，菌落初为白色透明，老熟后仍呈白色。在菌丝布满斜面后，在沿试管壁靠近培养基处，会有少许菌丝沿管壁攀爬伸展，因此可以推断在试管壁上能够沿伸生长的菌丝体，是依靠扎根在培养基内的基内菌丝输送营养。

根霉在液体培养基内是由两个生理上不同而且有一定亲和力的菌丝结合在一起，形成初生配子囊，吸收养分，逐渐成熟形成结合体新细胞，再进行繁殖，即为有性繁殖。此外，初生菌丝体延长，被搅拌断裂后又延伸生长，液体培养收率高，生物量高于固体培养，但工艺要求高。实验发现，在三角摇瓶液体振荡培养中，因振荡被甩到瓶壁上的菌液仍能沿瓶壁生长，形成菌膜。

通过以上两个试例可以了解根霉菌丝体在固体表面上生长迅速，有较强的攀爬延伸能力，形成菌丝体膜层，这就为透析膜培养打下基础，应用透析膜培养技术可以将固、液体培养整合在一起，放在一个环境中进行。

2 根霉透析膜培养原理

利用透析膜将两相隔开，方法是在液体培养基上放置一块透析膜，微生物点种在透析膜上，营养物质经扩散渗透至透析膜，而微生物通过透析膜吸取营养，在膜固体表面上生长延伸，累积生物量，即营养依靠液体输运，而菌的培养生长则在膜固体表面上进行，将液、固培养有机结合。

3 根霉透析膜培养方法

3.1 材料

根霉M101（上海工业微生物研究所）、麦芽汁（自制，大麦发芽，捣碎，糖化，去渣，过滤沉清，调整浓度为14°Bé）、再生纤维素透析膜、500 mL克氏瓶。

3.2 方法

另裁剪一块比克氏瓶底面积稍大的纤维素膜作为透析膜，取500 mL克氏瓶，装液量约60 mL作为培养基贮槽，高压灭菌后备用，灭菌后将其平铺在灭菌的克氏瓶培养液表面，然后将根霉菌点接种在透析膜上，共接5个点（平均分布），塞上棉塞，此时营养物质以扩散方式渗透通过透析膜供微生物生长需要。

3.3 培养

置32 ℃的恒温箱中培养36 h，菌丝布满整个透析膜，培养结束。

3.4 菌丝收率的检测

取一块滤纸称重，记录原始重量（a），收集刮下附在透析膜上的菌丝体，放在滤纸上，称重，记录此时重量值（b），然后置在80 ℃的干燥箱中烘干至恒重，记录此时的重量值（c）菌体湿重=重量b-重量a，菌体干重=重量c-重量a。

4 结果

培养8 h后可见在原接种点上有微小菌丝长出，之后逐渐长大，菌丝呈放射状沿膜表面伸展蔓延，菌落呈白色，至28 h后，原5个接种点长成的菌落彼此被联在一起，形成较厚的膜层，此时根霉生长处恒定期，生物量达最大，可以收获。菌丝经洗刮，称重，干燥处理，可得50 mL培养液菌体湿重10 g，干重2 g。

5 应用

5.1 直接用于酿酒

将菌丝体捣碎，以0.1%的接种量，拌入蒸熟的米饭中，32 ℃发酵培养，36 h后酿物成熟，酿成的甜酒酿口感鲜甜，露汁清亮，糖度均可达34°～36°。

5.2 作为种子使用，用于制曲

菌丝体捣碎兑水拌入灭菌的米粉中，按制曲工艺流程，制成的块曲、散曲产品质量都可达到和超过传统工艺方法制成的曲。

5.3 制成纯根霉制品

菌丝体加入填充料直接干燥脱水制成纯根霉菌体，塑料袋包装，在常温下贮藏半年，经检验根霉菌活力仍能保持原样，并未有减退。

6 讨论

6.1 透析膜的作用与选择

透析膜除可作为隔开相邻两相，以及调节营养物质的转移输送之外，也是根霉菌丝体赖依在固体基质上生长沿伸的支撑基料，是一种固体基质，膜的选择应考虑不被微生物分解和能耐蒸汽灭菌，因此膜应有一定的强度并且廉价易得。

6.2 麦芽培养基浓度的影响与作用

依据根霉的培养特性，有些根霉在老熟后会产生浓密的黑孢子，这对酿酒会产生负面的观感，因此应尽量选用产黑孢子少的菌种[4]。试验中发现提高麦芽汁培养基的浓度，可以防止根霉黑孢子的产生，这点可以在生产中推广、应用。

6.3 透析膜培养技术的作用与应用前景

提高原料收率是制曲追求的目标，即单位重量的原料应能尽可能产生收获更多的菌丝体生物量，比较各种制曲培养方法认为运用透析膜培养技术可以增加提高菌体的密度，最终可提高特定产物的再生产率。目前膜技术培养已首先在动物细胞生产干扰素，单克隆抗体等方面获得了应用，根霉的透析膜培养技术经过缜密的试验后，如能在实践中加以推广应用，这将彻底打破我国酒药生产，药拌草药，以及定时定节，固体传统培养作坊式生产的模式。