野生车前草总黄酮提取工艺

李季平，郭　婕

(周口师范学院 生命科学与农学学院，河南 周口 466001)

车前草为车前科多年生草本植物，为传统草药，在全世界广泛使用[1].药典中入药的大部分是其干燥全草，具有清热、利尿、凉血、祛痰、解毒等功效[2].此外，车前草还可食用[3]，主要以嫩叶和芽供食用.车前草中含多糖、黄酮、生物碱等[4]成分，其中黄酮类为车前草的主要有效成分之一，车前草的止咳、祛痰、抗哮喘作用与其有关[5].本实验采用单因素及正交试验，分析影响野生车前草总黄酮提取率的主要因素，并筛选出最佳提取条件.旨在为野生车前草的黄酮提取及合理利用提供一定的理论依据.

1　材料与方法

1.1　实验材料

车前草全草，2016年9月采于周口师范学院内.清洗干净，通风处晾干，用剪刀将其剪碎，长度约为2 mm，备用.

1.2　实验方法

1.2.1绘制标准曲线

以芦丁为标准品，参照总黄酮含量测定的经典方法[6]并稍加修改，求得标准方程为y=13.257x-0.003，R2= 0.999．其中y为吸光值，x为芦丁浓度(mg/mL)．

1.2.2单因素试验

乙醇浓度的筛选：分别设置乙醇为30%，45%，60%，75%，90%，功率为450 W，微波处理2 min，提取两次，合并提取液，研究乙醇浓度对车前草总黄酮提取率的影响.料液比的筛选：设置75%乙醇，功率为450 W，微波处理2 min，研究不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)对车前草总黄酮提取率的影响.微波处理时间的筛选：设置75%乙醇，功率为450 W，料液比1∶20，研究不同微波处理时间1、2、3、4、5 min对车前草总黄酮提取率的影响.微波功率的筛选：研究不同微波功率150、300、450、600、750 W对车前草总黄酮提取率的影响.

1.2.3正交试验

采用L9(34)正交表对以上四个因素进行正交试验进一步优化，确定车前草总黄酮的最佳提取工艺，正交试验设计安排见表1.

表1　正交试验设计

2　结果与讨论

2.1　单因素试验

2.1.1车前草总黄酮提取率与乙醇浓度的关系

图1表明，随着乙醇浓度的增加，车前草总黄酮提取率呈先增加后逐步减少的趋势，乙醇浓度至75%时，达到最高为2.41%.这主要是由于以低浓度乙醇作为提取剂时，提取液中水溶性杂质较多，而以高浓度乙醇提取时易带入色素及脂溶性物质，这些物质与黄酮类物质竞争，进而降低黄酮的提取率[7]，所以初步选择75%乙醇为提取剂.

图1　总黄酮提取率与乙醇浓度的关系图

2.1.2车前草总黄酮提取率与料液比的关系

图2　总黄酮提取率与料液比的关系图

图2表明，料液比1∶10至1∶15时，提取剂用量过小，车前草总黄酮提取率较低，当料液比增至1∶20时提取率达到最高为2.55%.料液比继续增加，总黄酮提取率出现下降趋势.料液比较小时，固液相中黄酮的浓度差偏小，提取不完全；提高溶剂用量，固液相中黄酮的浓度差增大，使得黄酮提取率增加[8]，但同时可能会使其他物质溶出增多.故初步选择料液比为1∶20.

2.1.3车前草总黄酮提取率与微波时间的关系

图3　总黄酮提取率与微波时间的关系图

图3表明，在一定时间范围内，车前草黄酮的提取率会随着微波时间的增加而提高；但微波时间过长，微波产生的热效会对黄酮类物质产生了破坏作用[9]，使得提取率下降.微波处理3 min时，提取率达到最高为2.64%.故初步选择微波时间为3 min.

2.1.4车前草总黄酮提取率与微波功率的关系

图4　 总黄酮提取率与微波功率的关系图

图4表明，微波功率从150 W增至450 W时，车前草总黄酮提取率有上升趋势，当微波功率为450 W时，黄酮提取率达到最高为2.77%.但微波功率增至600 W、750 W时，黄酮提取率开始下降.其原因可能是，微波功率过大时温度较高使可溶性蛋白质溶出发生变性，影响了细胞的破裂从而阻碍了黄酮的溶出，降低了总黄酮的提取率[10].为保证总黄酮充分提取，同时防止过高温度引起有效成分的分解，故初步选择微波功率为450 W.

2.2　优化结果

由表2可知，影响车前草总黄酮提取率的顺序从低到高依次为：微波功率、微波处理时间、料液比、乙醇浓度.表3方差分析显示各因素对车前草总黄酮提取率均有一定影响，其中乙醇浓度与料液比的影响表现显著(P<0.05).综合表2和表3结果可知，车前草总黄酮的最佳提取条件恰与正交试验表中的试验号5条件相重合，即乙醇浓度为75%，料液比为1∶20，微波时间为4 min，微波功率为300 W.经验证性试验，在此条件下总黄酮的提取率为2.91%，与正交试验表中试验号5的提取率2.908%相符.

表2　L9(34)正交试验结果

表3　方差分析

3　结论

以芦丁为标准品，利用分光光度法测定野生车前草中总黄酮的含量.并采用微波辅助法，以车前草总黄酮提取率为指标，通过单因素和正交试验筛选及优化车前草总黄酮的最佳提取工艺条件.结果显示，乙醇浓度与料液比对车前草总黄酮提取率的影响显著.同时确定了车前草中总黄酮的最佳提取工艺为：75%乙醇浓度、料液比为1∶20、微波处理4 min、微波功率为300 W，此时车前草中总黄酮的提取率为2.91%.

参考文献：

[1] HU Jielun, NIE Shaoping, LI Chang, et al. In vitro effects of a novel polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L. on intestinal function[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 54: 264-269.

[2]贯丹兵, 孙佩江, 孙丽滨. 车前草的药理研究[J]. 中草药, 1990, 21(1): 24-26.

[3] YIN Junyi, NIE Shaoping, LI Jing, et al. Mechanism of interactions between calcium and viscous polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(32): 7981-7987.

[4] 李敏, 程敏. 中药车前草化学成分与药理研究的新进展[J]. 现代中医药, 2005(3):60-61.

[5]朱光怡, 赵玉贵, 杨波. 中药车前草有效部位初探[J].黑龙江医药科学, 2005, 28(5):35-36．

[6] 元晓梅, 蒋明蔚, 胡正芝. 聚酰胺吸附-硝酸铝显色法测定山楂及山楂制品中的总黄酮含量[J]. 食品与发酵工业, 1996(4):27-32.

[7] 杨芳, 杨万林, 陈锦玉, 等. 苦荞壳总黄酮超声辅助醇提工艺的优化[J]. 食品与机械, 2015, 31(5):234-238.

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[9] 周倩, 滕建北, 颜萍花, 等. 正交实验优选鲫鱼胆总黄酮的最佳提取工艺[J]. 时珍国医国药, 2015, 26(9) :2118-2120.

[10] 宫玉婷, 王钰, 阿不都拉·阿巴斯. 梓树果实中黄酮类化合物提取工艺研究[J]. 食品科学,2008,29(4):193-195.