青藤碱与顺铂协同诱导人纤维肉瘤HT-1080细胞凋亡*

陈伟达，曾　嘉，梅世文，苗成利

(北京大学国际医院腹膜后肿瘤外科，北京 102206)

纤维肉瘤是一种常见的软组织肉瘤。在治疗上以手术切除为首选，放化疗为辅，但有50%的患者会出现复发和转移[1]，其平均生存期不足一年[2]。顺铂(cisplatin，DDP)是目前治疗纤维肉瘤的常用化疗药物，但较强的毒副作用以及耐药性的出现是限制其疗效的主要原因[3]。因此从天然植物化学成分中寻找安全有效的新型抗肿瘤药物成为目前研究的热点之一。青藤碱(sinomenine，SIN)是从中药青风藤中提取出的一种生物碱单体，具有抗炎、降压、镇痛和镇咳等药理作用。近年来研究发现，青藤碱对肝癌、肺癌、乳腺癌和骨肉瘤等恶性肿瘤具有显著的抑制作用[4-7]。但关于青藤碱能否提高纤维肉瘤对顺铂的敏感性目前尚不明确。本实验旨在体外观察青藤碱与顺铂联用对人纤维肉瘤HT-1080细胞的毒性作用，并在分子水平探讨其可能的分子机制，为青藤碱用于纤维肉瘤的治疗提供理论依据。

材　料　和　方　法

1　材料

人纤维肉瘤HT-1080细胞购自国家实验细胞资源共享平台。青藤碱购自中国药品生物制品检定所；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM培养基购自HyClone；顺铂购自Sigma；CCK-8试剂盒、RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；兔抗人铜离子转运蛋白1(copper transporter 1，CTR1)、谷胱甘肽S-转移酶π(gluta-thioneS-transferase-π，GST-π)、Bcl-2、Bax、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自Abcam。

2　方法

2.1细胞培养人纤维肉瘤HT-1080细胞用含10% FBS的DMEM培养液在37 ℃、5 % CO2条件下进行培养，每3～4 d 传代1次。

2.2药物配制将青藤碱和顺铂溶于无血清DMEM培养液配制成储存液，避光，-20 ℃保存备用。实验前用无血清DMEM培养液稀释成所需浓度的工作液。

2.3CCK-8法检测细胞活力取对数生长期HT-1080细胞，以每孔5×103个接种于96孔板，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。实验分成3组：(1)顺铂组：DMEM培养液更换为含有不同浓度顺铂(0.5、1、2、4和8 μmol/L)的工作液100 μL；(2)青藤碱组：DMEM培养液更换为含有不同浓度青藤碱(0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mmol/L)的工作液100 μL；(3)顺铂与青藤碱联用(DDP+SIN)组：DMEM培养液更换为含有顺铂和青藤碱的工作液100 μL，梯度浓度与上述两组相同，二者浓度比为1∶200。每个浓度设5复孔，同时设调零孔(无细胞)和对照孔(无药物作用)，培养48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养1 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长处的吸光度(A)值。调零孔A值校正各孔A值后，细胞抑制率(%)=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。

2.4药物联合应用评价采用Chou-Talalay中效分析法对CCK-8法检测结果进行分析。中效方程式为：fa/fu=(D/Dm)m，其中fa为抑制率，fu=1-fa，D为药物浓度，Dm为中效浓度，m为中效曲线斜率，分别将公式两边取对数得lg(fa/fu)=mlgD-mlgDm，设Y=lg(fa/fu)，X=lgD,b=m，a=mlgDm，得线性方程式:Y=a+bX。两药合用在不同效应的联合指数(combination index，CI)的计算公式为：CI=(D1/DX1)+(D2/DX2)，其中DX1和DX2为两药单用产生X效应时各自所需浓度，D1和D2为两药联用产生X效应时各自所需浓度，均可由中效方程式求得。应用CompuSyn 1.0软件绘制Fa-CI曲线，若CI<1，认为两药为协同作用，CI=1为相加作用，CI>1为拮抗作用。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期HT-1080细胞，制成密度为1×109/L的细胞悬液，以每孔2 mL接种于6孔板，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。将细胞分成无药对照(control)组、顺铂组(终浓度为2 μmol/L)、青藤碱组(终浓度为0.4 mmol/L)以及顺铂与青藤碱联合用药(DDP+SIN)组(终浓度分别为2 μmol/L和0.4 mmol/L)，每组设5个复孔，继续培养48 h。收集各组细胞，PBS洗涤1次，先加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光反应15 min，流式细胞仪分析检测。

2.6Western blot法检测蛋白水平细胞分组及处理方法同2.5，用RIPA裂解各组细胞提取总蛋白，用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，取25 μg蛋白样品进行SDS-PAGE并转移至PVDF膜，用脱脂奶粉封闭1 h，加入抗Bcl-2、Bax、CTR1、GST-π和β-actin的 I 抗(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶1 000稀释)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL试剂进行发光反应，用化学发光系统进行拍照，使用Image J 1.45S软件进行灰度分析。实验重复3次。

3　统计学处理

采用SPSS 16.0软件分析数据。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t检验进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　青藤碱与顺铂联合应用对HT-1080细胞活力的影响

CCK-8检测结果显示，HT-1080细胞经顺铂或青藤碱处理48 h，细胞活力均显著受到抑制(P<0.05)，IC50分别为6.50 μmol/L和1.06 mmol/L；当两种药物联合作用时，与顺铂单药相比，对细胞活力的抑制作用有不同程度的增强(P<0.05)，药物联合作用48 h的IC50为0.46 mmol/L，见图1。

Figure 1.The inhibition rate of HT-1080 cells induced by cisplatin and sinomenine.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsthe DDP group.
图1青藤碱与顺铂联合抑制HT-1080细胞活力

2　青藤碱与顺铂联合应用评价

由CompuSyn 1.0软件计算得出的Fa-CI曲线可知，当Fa<0.25时，CI>1，青藤碱与顺铂联用为拮抗效应；当Fa>0.25时，CI<1，两药合用产生协同效应，见图2。

Figure 2.The graph of combination index (CI) and fraction affected (Fa).
图2药物联合指数与抑制率曲线图

3　青藤碱与顺铂联合作用进一步促进HT-1080细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，HT-1080细胞经2 μmol/L顺铂或0.4 mmol/L青藤碱处理48 h后，细胞凋亡率分别为17.49%±4.78%和21.73%±3.95%，均明显高于对照组(P<0.05)；两药联合组的细胞凋亡率为42.58%±5.60%，与顺铂组相比显著升高(P<0.05)。表明青藤碱可协同增强顺铂诱导HT-1080细胞凋亡，见图3。

Figure 3.The effect of DDP and SIN on the apoptosis of HT-1080 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.
图3青藤碱和顺铂对HT-1080细胞凋亡的影响

4　青藤碱与顺铂联合应用对CTR1和GST-π蛋白水平的影响

CTR1是细胞摄取顺铂的重要途径，上调CTR1表达可增加顺铂在细胞内的积累量[8]。GST-π可催化谷胱甘肽与顺铂共价结合而使之失活[9]。Western blot实验的结果显示，与对照组相比，顺铂组CTR1蛋白水平显著降低(P<0.05)，GST-π蛋白水平显著升高(P<0.05)；与之相反，青藤碱组CTR1蛋白水平显著升高(P<0.05)，GST-π蛋白水平则明显下降(P<0.05)；与顺铂组相比，两药联合组CTR1蛋白水平显著升高(P<0.05)，GST-π蛋白水平显著下降(P<0.05)，见图4。

5　青藤碱与顺铂联合应用对Bcl-2和Bax蛋白水平的影响

Bcl-2家族在调控细胞凋亡中发挥着重要作用。Western blot实验的结果显示，与对照组相比，顺铂组和青藤碱组Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)，Bax蛋白水平显著升高(P<0.05)；与顺铂组相比，两药联合组Bcl-2蛋白水平显著进一步下降(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，见图5。

Figure 4.The effect of DDP and SIN on the protein levels of CTR1 and GST-π in the HT-1080 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.
图4青藤碱和顺铂对CTR1和GST-π蛋白水平的影响

Figure 5.The effect of DDP and SIN on the protein levels of Bcl-2 and Bax in the HT-1080 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.
图5青藤碱和顺铂对Bcl-2和Bax蛋白水平的影响

讨　　论

在本研中，我们采用CCK-8法检测了青藤碱与顺铂对人纤维肉瘤HT-1080细胞的毒性作用，结果表明青藤碱与顺铂均可显著抑制HT-1080细胞活力且具有剂量依赖性，两药联用则对细胞活力的抑制作用更加显著。进一步采用Chou-Talalay中效分析法对两药的联合效应进行评价后发现，当抑制率超过25%时，两药联用可产生协同效应。与之相一致，流式细胞术检测结果也表明，青藤碱既可导致HT-1080细胞凋亡，也能协同增强顺铂诱导的细胞凋亡。上述结果说明，青藤碱可增强人纤维肉瘤HT-1080细胞对顺铂的敏感性。

顺铂在临床上被广泛用于不同恶性肿瘤的治疗,如肺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌和肉瘤等。在顺铂化疗初期虽然可以获得较好的治疗效果，但其较强的毒副作用以及逐渐产生的耐药性已成为限制其疗效的主要因素。顺铂耐药性的产生涉及多种机制，其在细胞内积累量的减少是其中重要原因之一。目前多项实验数据表明，胞膜上的CTR1是细胞摄取顺铂的重要途径之一[10-13]。Öhrvik等[11]研究证实，CTR1胞外段可直接与顺铂结合，组织蛋白酶L/B是裂解CTR1胞外段的限速酶，其抑制剂可增加细胞对顺铂的摄取进而增强顺铂的毒性作用。Wang等[12]采用RNA干扰技术沉默CTR1基因表达可降低人卵巢癌OVCAR3细胞对顺铂的敏感性。

由于细胞内的氯离子浓度较低，当顺铂进入细胞后，其氯配体先被水分子取代形成水合物，然后与细胞内大分子的亲核基团结合，DNA是其主要的作用靶点。顺铂与DNA形成的不同类型的复合物成能够抑制细胞的转录和复制过程，从而诱导细胞凋亡[14]。在GST-π的催化下，胞质中的顺铂可与谷胱甘肽结合形成复合物，这不仅使顺铂无法进入细胞核与DNA结合，还有利于肿瘤细胞将其转移至胞外，从而降低顺铂的细胞毒性作用[9]。

在本研究中，我们发现顺铂可下调HT-1080细胞中CTR1的蛋白水平和上调GST-π的蛋白水平，而青藤碱对CTR1和GST-π蛋白水平的调控则与之相反，两药联用可消除顺铂对CTR1和GST-π蛋白水平的影响。这提示，青藤碱可能通过上调CTR1蛋白水平和下调GST-π蛋白水平增加顺铂在细胞内的积累量，以提高顺铂的细胞毒性作用。

由于顺铂通过诱导凋亡的方式杀死肿瘤细胞，Bcl-2家族蛋白水平的变化会影响顺铂的细胞毒性作用。Bcl-2家族根据结构和功能可以分为2大类：一类是抗凋亡蛋白，主要有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W和Mcl-1等，另一类是促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak、Bad和Bid等。当Bcl-2表达上调和Bax表达下调时，顺铂所诱导的细胞凋亡可被显著抑制[15-16]。本研究结果显示，青藤碱和顺铂均可显著上调Bax蛋白水平以及下调Bcl-2蛋白水平，二者联用可协同增强对Bax和Bcl-2蛋白水平的调控。这初步揭示了青藤碱增强顺铂诱导HT-1080细胞凋亡的分子机制。

综上所述，青藤碱可协同增强人纤维肉瘤HT-1080细胞对顺铂的敏感性，这可能与青藤碱上调CTR1和Bax蛋白水平以及下调GST-π和Bcl-2蛋白水平有关。

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